(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210293418.0 (22)申请日 2022.03.24 (71)申请人 郑州轻工业大 学 地址 450000 河南省郑州市高新 技术产业 开发区科 学大道136号 (72)发明人 白艳红　杜娟　赵电波　刘佳蕾　 刘楷　李宗双　栗俊广　相启森　 刘骁　 (74)专利代理 机构 郑州联科专利事务所(普通 合伙) 41104 专利代理师 杨海霞 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01)G01N 33/543(2006.01) G01N 33/52(2006.01) G01N 33/58(2006.01) G01N 33/68(2006.01) C12R 1/01(2006.01) C12R 1/42(2006.01) C12R 1/19(2006.01) C12R 1/445(2006.01) C12R 1/63(2006.01) C12R 1/385(2006.01) (54)发明名称 多重PCR与胶体金试纸条联合高通量检测致 病菌的方法 (57)摘要 本发明公开了一种多重PCR与胶体金试纸条 联合高通量检测致病菌的方法： 根据三种不同致 病菌的特异性基因片段分别设计一对 上、 下游引 物， 且上游引物5'端修饰巯基， 下游引物5'端分 别修饰生物素、 荧光素和地高辛； 将三种致病菌 样品用PBS洗涤并重悬于PBS中， 煮沸8 ‑15min后 冷却至室温， 离心， 分别取上清DNA并进行多重 PCR扩增， 获得PCR产物； PCR产物与胶体金结合， 封闭后滴加至试纸条上， 肉眼观察结果。 本发明 利用PCR扩增技术来提高检测食源性致病菌的灵 敏度， 具有高通量检测、 灵敏度高、 特异性强、 耗 时短等优点， 适用于致病菌的检测。 权利要求书1页 说明书6页 附图2页 CN 114525352 A 2022.05.24 CN 114525352 A 1.一种多重PCR与胶体金试纸条联合高通量检测致病菌的方法， 其特征在于， 包括如下 步骤： a） 根据三种不同致病菌的特异性基因片段分别设计一对上、 下游引物， 且上游引物5' 端修饰巯基， 下游引物5'端分别修饰生物素、 荧 光素和地高辛； b） 将三种致病菌样品用PBS洗涤并重悬于PBS中， 煮沸8 ‑15min后冷却至室温， 离心， 分 别取上清DNA并利用步骤a） 中的引物进行多重PCR扩增， 获得PCR产物； c） PCR产物与胶体金结合， 离心、 弃上清， 用含10%  BSA的PBS封闭后滴加至试纸条上， 肉 眼观察结果。 2.如权利要求1所述多重PCR与胶体金试纸条联合高通量检测致病菌的方法， 其特征在 于， 步骤a） 中， 所述致病菌为单核细胞增生李 斯特菌、 鼠伤寒沙门氏菌、 大肠杆菌、 金黄 色葡 萄球菌、 副溶 血性弧菌或铜绿假单 胞菌。 3.如权利要求1所述多重PCR与胶体金试纸条联合高通量检测致病菌的方法， 其特征在 于， 步骤c） 中， 所述胶体金经下述步骤制备获得： 在milli  Q超纯水中加入HAuCl4溶液至 HAuCl4终浓度为0.1mM， 混匀， 搅拌加热至沸腾； 加入1%柠檬酸钠溶液并维持加热7 ‑10min,  室温冷却， 即得。 4.如权利要求1所述多重PCR与胶体金试纸条联合高通量检测致病菌的方法， 其特征在 于， 步骤c） 中， 所述试纸条包括底板、 以及依次粘接在底板上的样品垫、 硝酸纤维素膜和吸 水垫； 所述硝酸纤维素膜上有三条检测线， 所述检测线 上分别包被有抗生物素抗体、 抗荧光 素抗体、 抗 地高辛抗体。 5.如权利要求4所述多重PCR与胶体金试纸条联合高通量检测致病菌的方法， 其特征在 于， 所述样品垫的材质为聚酯纤维素膜， 所述吸水垫的材质为吸水 滤纸。 6.如权利要求4所述多重PCR与胶体金试纸条联合高通量检测致病菌的方法， 其特征在 于， 用磷酸缓冲液将抗生物素抗体稀释后， 用划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上形成第一 条检测线； 用磷酸缓冲液将抗荧光素抗体稀释后， 用划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上形 成第二条检测线； 用磷酸缓冲液将抗地高辛抗体稀释后， 用划膜仪将其包被于硝酸纤维素 膜上形成第三条检测线； 将包被好的硝酸纤维素膜置 于30‑45℃条件下干燥1 ‑4 h。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114525352 A 2多重PCR与胶体 金试纸条联合高通量 检测致病菌的方 法 技术领域 [0001]本发明属于食品安全技术领域， 涉及纳 米技术和生物技术。 具体地， 尤其涉及一种 多重PCR与胶体金试纸条联合高通量检测致病菌方面的方法， 其利用多重P CR扩增技术来提 高检测食 源性致病菌的灵敏度。 背景技术 [0002]随着食品工业的发展， 食品安全问题成为了食品行业以及各界关注的焦点问题 之 一， 其中食源性致病菌的产生是发生食品安全问题的一个重要原因。 食品中由单核细胞增 生李斯特菌( L. monocytogenes )、 大肠杆菌O157:H7 （ E.coli O157:H7） 和鼠伤寒沙门氏菌 (S. typhimurium )等微生物引起的疾病发病率显著增加。 而食源性致病菌检测技术的关键 就是要有较高的灵敏度、 较强的专一性以及尽可能短的分析时间,而现阶段 的检测技术不 足以对其顺利进行同步、 精确及快速的检测,所以很多新型 的检测方式已被视为研究的首 选。 由于纳米材 料具有更大的比表面积和特殊的性质， 应用更广泛。 [0003]目前普通的PCR扩增技术通常通过凝胶电泳法读取结果， 这种方法具有耗时、 灵敏 度低的缺 点。 针对于此， 特提出 此发明。 发明内容 [0004]本发明目的在于克服现有技术缺陷， 提供一种多重PCR与胶体金试纸条联合高通 量检测致病菌方面的方法， 其将纳米材料胶体金与试纸条联合来检测食源性致病菌。 本发 明利用多重P CR扩增技术来提高检测食源性致病菌的灵敏度， 具有高通量检测灵敏度高、 特 异性强、 检测时间短等优点， 特别适用于致病菌的检测。 [0005]为实现上述目的， 本发明采用如下技 术方案： 一种多重PCR与胶体金试纸条联合高通量检测致病菌的方法 （检测原理如图1所 示） ， 其包括如下步骤： a） 根据三种不 同致病菌的特异性基因片段分别设计一对上、 下游引物， 且上游引 物5'端修饰巯基， 下游引物5'端分别修饰生物素、 荧 光素和地高辛； b） 将三种致病菌样品用PBS洗涤并重悬于PBS中， 煮沸8 ‑15min后冷却至室温， 离 心， 分别取上清DNA并利用步骤a） 中的引物进行多重PCR扩增， 获得PCR产物； 具体为： 各取2   μL上清DNA， 步骤a） 中的引物各2  μL， 25  µL 2× Taq PCR Master Mix buffer， 加ddH2O至 50 μL进行 PCR反应； PCR混合物先在95℃预变性5  min， 开始循环过程， 首先9 5℃变性30  s、 53℃退火30  s、 72℃延伸30  s， 共进行32 个循环。 最后， 在72℃下继续伸展10分钟即得PCR产 物； c） 50 μL PCR产物与50  μL 胶体金在低pH溶液 （pH=3的柠檬酸缓冲液） 中结合， 离 心、 弃上清， 用含10%  BSA的PBS封闭后滴加至试纸条 上， 肉眼观察结果。 [0006]具体的， 步骤a） 中， 所述致病菌为单核细胞增生李斯特菌、 鼠伤寒沙门氏菌、 大肠 杆菌O157:H7、 金黄色葡萄球菌、 副溶血性弧菌或铜绿假单胞菌等。 待测的食源性致病菌样说　明　书 1/6 页 3 CN 114525352 A 3