(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210286979.8 (22)申请日 2022.03.23 (71)申请人 昆明理工大 学 地址 650093 云南省昆明市五华区学府路 253号 (72)发明人 郑伟　颜成敏　徐晓丹　 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 鉴别‘洋红松子壳 ’滇山茶品种的分子特异 性标记引物及鉴定方法 (57)摘要 本发明公开了鉴别 ‘洋红松子壳 ’滇山茶品 种的分子 特异性标记引物及鉴定方法； 所述引物 序列为上游引物： 5' ‑ACATCGAAGAGCATGGCACA ‑ 3'； 下游引物： 5' ‑GCCCCAAACTAGCACTCTCT ‑3'。 利 用本发明开发的分子特异性标记引物能对 ‘洋红 松子壳’滇山茶品种 与其它滇山 茶主要栽培品种 进行快速、 准确的分子鉴定， 尤其适合对未到花 期植株的滇山茶品种的早期鉴定， 以及形态特征 相似的品种进行鉴别。 权利要求书1页 说明书8页 序列表1页 附图1页 CN 114574619 A 2022.06.03 CN 114574619 A 1.‘洋红松子壳 ’滇山茶品种的分子特异性标记引物， 其特征在于， 该特异性标记引物 序列如下： 上游引物： 5' ‑ACATCGAAGAGCATG GCACA‑3'； 下游引物： 5' ‑GCCCCAAACTAGCACTCTCT ‑3'。 2.一种利用权利要求1所述的分子特异性标记引物对 ‘洋红松子壳 ’滇山茶品种 进行鉴 定的方法， 其特 征在于所述方法为： (1)提取待测滇山茶品种叶片的基因 组DNA； (2)以步骤(1)提取的滇山茶品种叶片的基因组DNA作 为扩增模板， 利用权利 要求1所述 分子特异性标记引物作为扩增引物， 进行PCR扩增， 获得PCR扩增产物； (3)对步骤(2)中的扩增产物进行电泳检测， 电泳结束后用EB染色， 于Tanon凝胶成像仪 拍照记录结果， 将电泳结果与DL2000Marker进行对比， 若条带大小为800bp， 则对扩增产物 进行DNA双向测序， 获得扩增产物DNA序列； (4)如步骤(3)中所述扩增产物的DNA序列能与NCBI线上数据库的单拷贝核基因序列成 功比对， 且在431b p位点的核苷 酸碱基为特异 性位点G， 则待测滇山茶品种为 ‘洋红松子壳 ’， 反之则否。 3.如权利要求2所述的对 ‘洋红松子 壳’滇山茶品种 进行鉴定的方法， 其特征在于， 步骤 (1)中所述提取待测 滇山茶品种叶片的基因组DNA的方法为： 取待测滇山茶叶片， 加液氮磨 碎后， 以改良CTAB法进行基因 组DNA提取。 4.如权利要求2所述的对 ‘洋红松子 壳’滇山茶品种 进行鉴定的方法， 其特征在于， 步骤 (2)中所述CR扩增体系， 每50 μL组成为： 25 μL  Taq混合物； 1μL  DNA模板； 22 μL  ddH2O； 1μL浓 度为10p的上游引物； 1 μL浓度为10p的下游引物。 5.如权利要求2所述的对 ‘洋红松子 壳’滇山茶品种 进行鉴定的方法， 其特征在于， 步骤 (2)中所述PCR扩增条件为： 在98℃下初始变性2min， 再在98℃下变性10s， 60℃退火10s， 72 ℃下延伸20s， 进行3 5个循环； 最后在72℃下延伸5分钟。 6.如权利要求2所述的对 ‘洋红松子 壳’滇山茶品种 进行鉴定的方法， 其特征在于， 所述 步骤(3)中的电泳检测方法为： 取步骤(2)中的扩增产物2 μL， 与6 μL  1×溴酚蓝缓冲液混匀， 点样于1.0％的琼脂糖凝胶上， 于 0.5×TBE缓冲液中， 恒压 300V电压下电泳12分钟。 7.如权利要求2所述的对 ‘洋红松子 壳’滇山茶品种 进行鉴定的方法， 其特征在于， 步骤 (3)中所述扩增产物进行DNA双向测序时采用一代373 0测序仪。 8.如权利要求2所述的对 ‘洋红松子 壳’滇山茶品种 进行鉴定的方法， 其特征在于， 步骤 (4)中所述单拷贝 核基因长度为786bp， 在NCBI线上 数据库的GenBan k登录号为MH257932。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114574619 A 2鉴别‘洋红松子壳 ’滇山茶品种的分子特异性标记引物及鉴定 方法 技术领域 [0001]本发明涉及鉴别 ‘洋红松子壳 ’滇山茶品种的分子特异性标记引物， 以及该特异性 标记引物对 ‘洋红松子壳 ’滇山茶品种进行 快速鉴定的方法。 背景技术 [0002]滇山茶(Camellia  reticulata)， 属于山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)红山 茶组(sect  Camellia)， 常绿阔叶乔木。 滇山茶原产中国云南， 适应我国西南山地及其独特 的高原季风气候， 是中国的特有种、 国家重点二级保护植物， 且被IUCN(International   Union for Conservation  of Nature)列 为“vulnerable ”(易危种)。 它不仅是世界珍稀花 卉之一、 最受云南人民喜爱的八大名花之首， 同时也是云南省花、 昆明市花， 更是被广泛认 可的古老而名贵的观赏树木， 已被作为观赏植物栽培了1500多年， 具有极高的经济价值。 加 之我国民众自古即高度重视观 赏树木的文化韵味， 千姿 百态、 变化多端的滇山茶之娇艳， 被 广泛地应用到了 园林绿化及盆栽观赏中。 此外， 又由于其树体高大(最高25m)而名扬海外， 受到世界园艺界的珍视， 先后被引种到全球多地进行栽培 。 [0003]滇山茶栽培种质的变异丰富， 园艺品种有100多个， 其中不乏价格昂贵的名贵品 种， 如‘恨天高’、‘紫袍’、‘洋红松子壳 ’等。 实践中， 一些品种的形态特征相似度高， 很难从 形态特征上进行鉴别， 能准确掌握滇山茶的形态分类技术的仅有少数专业人士， 给滇山茶 的应用、 推广以及新品种选育带来很多困难。 尤其是以下两个问题 一直较难解决： 一是未到 花期植株的品种早期鉴定， 二是 形态特征相似的品种鉴别。 [0004]鉴于上述情况， 有必要研究鉴别 ‘洋红松子壳 ’滇山茶品种的分子特异性标记引物 及鉴定方法以解决上述 技术问题。 发明内容 [0005]本发明的第一个目的在于提供 ‘洋红松子壳 ’滇山茶品种的分子特异性标记引物， 本发明的第二个目的在于提供利用的分子特异性标记引物对 ‘洋红松子壳 ’滇山茶品种进 行鉴定的方法。 本发明旨在解决无法对未到花期且形态特征相似的滇山茶 品种进行早期鉴 定的技术问题。 [0006]为了实现上述目的， 本发明采用如下技 术方案： [0007]本发明的第一个目的是这样实现的， ‘洋红松子壳 ’滇山茶品种的分子特异性标记 引物， 该特异性标记引物序列如下： [0008]上游引物： 5' ‑ACATCGAAGAGCATG GCACA‑3'； [0009]下游引物： 5' ‑GCCCCAAACTAGCACTCTCT ‑3'。 [0010]该引物经过大量筛选试验获得滇山茶品种能够在滇山茶及近缘物种中扩增出直 系同源的单拷贝核基因。 所述引物扩增的单拷贝核基因在NCBI线上数据库的GenBank登录 号为MH257932， 长度786bp， 在431bp位点的核苷 酸碱基为G， 具有特异性， 能与其它滇山茶品说　明　书 1/8 页 3 CN 114574619 A 3