(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210289507.8 (22)申请日 2022.03.23 (71)申请人 深圳大学总医院 地址 518000 广东省深圳市南 山区桃源街 道大学城学苑大道1098号 (72)发明人 龚勋　李晓武　刘玉琛　 (74)专利代理 机构 深圳市深弘广联知识产权代 理事务所(普通 合伙) 44449 专利代理师 向用秀 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) G16B 25/10(2019.01) (54)发明名称 检测胰腺癌预后情况的试剂盒 (57)摘要 发明公开了一种检测胰腺癌预后情况的试 剂盒， 试剂盒中包含有miRNA的上下游引物序列、 U6的上下游引物序列和辅助组分， miRNA包括有 miRNA934,miRNA4444 ‑2,miRNA3655,miRNA1301 分子中的一条或多条， 通过试剂盒与经过处理后 的胰腺癌患者预后的离体样本中的miRNA进行检 测， 获得miRNA组合在样本中的表达， 根据表达量 高低的组分来确定患者胰腺癌预后情况， 本发明 通过对患者样本中特异性表达的4个miRNA的表 达情况进行了检测， 并建立区分胰腺癌患者预后 不良的诊断试剂盒， 可以全面提高对胰腺癌预后 疗效及转移、 复发预测的准确度。 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 CN 114438217 A 2022.05.06 CN 114438217 A 1.一种检测胰腺癌预后情况的试剂盒， 其特征在于， 试剂盒中包含有miRNA的上下游引 物序列、 U6的上下游引物序列和辅助组分， miRNA包括有miRNA934,miRNA4444 ‑2, miRNA3655,miRNA1301分子中的一条或多条， 通过试剂盒与经过处理后的胰腺癌患者预后 的离体样本中的miRNA进行检测， 获得miRNA组合在样本中的表达， 根据表达量高低的组分 来确定患者胰腺癌预后情况。 2.根据权利要求1所述的检测胰腺癌预后情况的试剂 盒， 其特征在于， 对胰腺癌患 者预 后的样本处 理过程如下： S1:测定离体样本中异常表达的miRNA 表达水平； S2： 比较被测定离体样本中与参考样本与配对 的正常胰腺组织中miRNA分子是否存在 差异表达， 表达 差异与胰腺癌 患者预后复发或转移是否具有相关性。 3.根据权利要求2所述的检测胰腺癌预后情况的试剂 盒， 其特征在于， 离体样本包括胰 腺癌组织样本、 血 液、 血浆中的一种或多种。 4.根据权利要求2所述的检测胰腺癌预后情况的试剂盒， 其特征在于， 在步骤S2中， 差 异表达的为患者的临床病例特征， 其中临床病例特征包括患者性别、 年龄、 肿瘤部位、 肿瘤 直径、 组织分化 程度、 肿瘤浸润深度、 淋巴结转移、 远处转移、 TNM分期及5年存活率。 5.根据权利要求1所述的检测胰腺癌预后情况的试剂盒， 其特征在于， 辅助组分包括 RNA提取系统、 逆转录试剂及PCR扩增试剂。 6.根据权利要求5所述的检测胰腺癌预后情况的试剂盒， 其特征在于， RNA提取系统包 括裂解液、 RNA吸附柱和RNA漂洗液； 逆转录试剂为反应混合液、 逆转录酶和超纯 水。 7.根据权利要求1所述的检测胰腺癌预后情况的试剂 盒， 其特征在于， 试剂 盒中还含有 胰腺癌组织样本提取的总RNA混合后， 逆转录并稀释的cDNA。 8.根据权利要求1所述的检测胰腺癌预后情况的试剂盒， 其特征在于， miRNA的识别过 程如下： A1： 在癌症基因 组图谱中下 载胰腺癌的miRNA和mRNA和临床数据； A2:利用R软件中的DESeq2筛 选出mRNA差异 表达基因， 并将根据差异基因作热图； A3:利用G O注释和KEG G途径对差异 表达基因进行分析， 筛 选出miRNA的差异基因； A4： 利用3个R包miRNAtap， multiMiR和hoardeR找到差异miRNA的靶基 因， 并且根据该靶 基因进行G O注释和KEG G途径进行分析。 A5： 利用DEmiRNA的靶基因和差异基因建立miRNA ‑mRNA共表达网络； 并且在共表达网络 中的差异基因做GO ‑KEGG功能富集分析； DEmiRNA做生存曲线分析， 从而得到转移性和非转 移性胰腺癌样品中表达mRNA和miRNA。 9.根据权利要求8所述的检测胰腺癌预后情况的试剂盒， 其特征在于， 在步骤A5后， 利 用Lasso回归模型针对miRNA构建比例风险回归模型， 根据最后剩余的miRNA的组合从而判 断胰腺癌预后危险因素 是否会发生。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114438217 A 2检测胰腺癌预后情况的试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及生物医药 领域， 尤其涉及一种检测胰腺癌预后情况的试剂盒。 背景技术 [0002]胰腺癌(PAAD)是总体肿瘤类型中最致命的癌症之一。 由于PAAD发病隐匿、 异质性 强， 在早期不易发现， 仅在疾病晚期出现， 导致5年生存率极低， 仅为～10％。 有机会接受手 术切除的患者比例不到20％。 此外， 接受完全肿瘤切除的PAAD患者通常会在2 年内出现局部 或远处复发。 因此， PA AD治疗仍然是一个重大挑战， [0003]PAAD的不良预后可能是由于其侵袭转移、 对治疗产生耐药， 缺乏早期筛查标志物 和诊断方法所致。 传统的预后预测方法是基于患者年龄、 一般健康状况、 合并症和耐受治疗 的能力， 还包括组织学分级、 淋巴结或远处转移、 血管和血管周围浸润和 CA199等临床病例 特征。 然而， 由于PAAD的肿瘤异质性和恶性程度之高， 迄今为止几乎没有临床益处。 因此， 仍 然急需更好的方法对胰腺癌患者 五年复发转移 风险以及辅助化疗获益进 行预测， 使部 分早 期胰腺癌患者， 避免痛苦的化疗。 随着非编码RNA作为肿瘤标志物的出现， 提示在肿瘤发生 发展过程中， microRNA比受体、 蛋白等出现得 更早， 而这对肿瘤的诊断尤为重要。 [0004]随着新一代测序技术的快速发展技术， 大多数人类癌症现在已经全面分析， 这导 致了对以前未知的分子亚型的识别， 从而改善了预后、 诊断和肿瘤精准医疗。 尽管从生物学 的角度来看分子亚型很有趣， 但由于每个亚型都有数百个基因特征， 并且针对预后不良的 亚型引入了各种分子亚型分类标准， 但对每个患者进行转录组分析 的难度， 其转化为临床 实践一直具有挑战性。 已有大量研究证明， microRNA(miRNA)表达在恶性肿瘤中经常失调， 单个miRNA可以调节数十种靶基因的表达， 新出现的证据突出了miRNA作为癌症生物标志物 的潜力， 且mi RNA是比其他已知生物标志物更好的生物标志物， 在临床前研究中显示出治疗 疾病的有益效果。 综合起来， 一组预后miRNA可能为PAAD患者分层和分子 分型提供更强大且 具有临床意 义的特征。 发明内容 [0005]针对上述技术中存在的不足之处， 本发明提供一种检测胰腺癌预后情况的试剂 盒， 通过对患者样本中特异性表达的4个miRNA的表达情况进行了检测， 并建立区分胰腺癌 患者预后不良的诊断试剂盒， 可以全面 提高对胰腺癌预后疗效及转移、 复发预测的准确度。 [0006]为实现上述目的， 本发明提供一种检测胰腺癌预后情况的试剂盒， 试剂盒中包含 有miRNA的上下游引物序列、 U6的上下游引物序列和辅助组分， miRNA包括有miRNA934, miRNA4444 ‑2,miRNA3655,miRNA1301分子 中的一条或多条， 通过试剂盒与 经过处理后的胰 腺癌患者预后的离体样本中的miRNA进行检测， 获得miRNA组合在样本中的表达， 根据表达 量高低的组分来确定患者胰腺癌预后情况。 [0007]作为优选， 对 胰腺癌患者预后的样本处 理过程如下： [0008]S1:测定离体样本中异常表达的miRNA 表达水平；说　明　书 1/5 页 3 CN 114438217 A 3