(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210294889.3 (22)申请日 2022.03.23 (71)申请人 中国疾病预防控制中心传染病预防 控制所 地址 102206 北京市昌平区昌百路15 5号 (72)发明人 张茂俊　王海瑞　顾一心　 (74)专利代理 机构 深圳市兰锋盛世知识产权代 理有限公司 4 4504 专利代理师 罗炳锋 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 检测弯曲菌的引物组、 探针及其试剂盒、 应 用与检测方法 (57)摘要 本申请适用于生物检测技术领域， 提供了检 测弯曲菌的引物组、 探针及其试剂盒、 应用与检 测方法， 所述引物组为通用引物组或特异引物 组。 通过本申请建立的弯曲菌检测方法可快速检 测6种重要的食源性弯曲菌的有无， 同时对6个菌 种进行菌种的鉴别， 可以在确定食源性弯曲菌感 染的同时确定感染的菌种； 另外， 本申请建立的 弯曲菌检测方法不仅可以进行纯培养细菌的鉴 定， 还可以进行标本的检测； 同时， 本申请将补充 到国家标准中食源性弯曲菌的鉴定， 辅助弯曲菌 的生化鉴定。 权利要求书1页 说明书30页 序列表4页 附图5页 CN 114606328 A 2022.06.10 CN 114606328 A 1.检测弯曲菌的引物组， 其特征在于， 所述引物组为通用引物组或特异引物组， 所述特 异引物组为特异引物组1、 特异引物组2、 特异引物组3、 特异引物组4、 特异引物组5、 特异引 物组6中的一组或几组； 其中， 所述通用引物组由引物序列SEQ  ID NO:1以及SEQ  ID NO:2组成， 或者 由所述引 物序列的核苷酸互补序列组成； 所述特异引物组1由引物序列SEQ  ID NO:3以及SEQ  ID NO:4组成， 或者由所述引物序 列的核苷酸互补序列组成； 所述特异引物组2由引物序列SEQ  ID NO:5以及SEQ  ID NO:6组成， 或者由所述引物序 列的核苷酸互补序列组成； 所述特异引物组3由引物序列SEQ  ID NO:7以及SEQ  ID NO:8组成， 或者由所述引物序 列的核苷酸互补序列组成； 所述特异引物组4由引物序列SEQ  ID NO:9以及SEQ  ID NO:10组成， 或者由所述引物序 列的核苷酸互补序列组成； 所述特异引物组5由引物序列SEQ  ID NO:11以及SEQ  ID NO:12组成， 或者由所述引物 序列的核苷酸互补序列组成； 所述特异引物组6由引物序列SEQ  ID NO:13以及SEQ  ID NO:14组成， 或者由所述引物 序列的核苷酸互补序列组成。 2.检测弯曲菌的探针， 其特征在于， 探针序列为SEQ  ID NO:15、 SEQ  ID NO:16、 SEQ  ID  NO:17、 SEQ  ID NO:18、 SEQ  ID NO:19、 SEQ  ID NO:20、 SEQ  ID NO:21或者为所述探针序列的 核苷酸互补序列中的一种或几种。 3.根据权利要求1所述的引物 组和/或权利要求2所述的探针在制备弯曲菌检测试剂 盒 或者检测试剂中的应用。 4.检测弯曲菌的试剂盒， 其特 征在于， 含有权利要求1所述的引物组。 5.根据权利要求4所述的检测 弯曲菌的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒还含有权利要 求2所述的探针。 6.根据权利要求5所述的检测弯曲菌的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还含有： Passive Reference  Dye、 qPCRMix、 H2O。 7.根据权利要求 4‑6任一权利要求所述的试剂盒在检测弯曲菌中的应用。 8.一种弯曲菌的检测方法， 其特 征在于， 包括： 获取待检测样本的模板DNA； 将所述模板DNA、 Passive  Reference  Dye、 qPCR  Mix、 权利要求1所述的引物组、 权利要 求2所述的探针以及H2O按照预定的配制方法配制PCR反应 体系； 将所述PCR反应 体系在预设的扩增程序下进行PCR反应， 以对弯曲菌进行检测。 9.根据权利要求7所述的弯曲菌的检测方法， 其特征在于， 所述预设的扩增程序为： 预 变性94℃3 0s； 变性94℃5s， 退火6 0℃30s， 40个循环。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114606328 A 2检测弯曲 菌的引物组、 探针及其试剂盒、 应用与检测方 法 技术领域 [0001]本申请属于生物检测技术领域， 尤其涉及检测弯曲菌的引物组、 探针及其试剂盒、 应用与检测方法。 背景技术 [0002]弯曲菌属(Campylobacter)是弯曲菌科的一个菌属， 是一种微需氧的革兰阴性菌。 目前发现的弯曲菌属内有30多个菌种和亚种。 弯曲菌属内部分菌种定植在人和动物的肠 道， 可导致人的胃肠道疾病； 部分菌种仅定植在人的口腔内， 与口腔及牙周疾病相关。 弯曲 菌感染导致的疾病， 称为弯曲菌病。 弯曲菌病的主要传播途径是粪 ‑口途径。 被污染的食物、 水以及外环境通常是导致疾病的主要传染源。 通过食物传播的弯曲菌统称为食源性弯曲 菌。 目前发现的重要的食源性弯曲菌有6种， 包括空肠弯曲菌、 结肠弯曲菌、 红嘴鸥弯曲菌、 乌普萨拉弯曲菌、 猪肠弯曲菌、 瑞士弯曲菌 。 [0003]食源性弯曲菌是导致人类胃肠道疾病的重要病原菌。 经济发达国家食源性弯曲菌 的感染位居食源性病原感染的首位， 发展中 国家的感染率通常是发达国家的100倍。 食源性 弯曲菌是5岁以下儿童腹泻的重要病原菌。 除肠炎以外， 空肠弯曲菌的感染还可导致格林 ‑ 巴利综合征、 反应性关节炎等疾病， 使弯曲菌感染的疾病负担更加 严重。 因此， 食品中食源 性弯曲菌的检测和监测一直是国内外食品安全以及病原病原感染防控关注的焦点。 而且， 作为人兽共患的病原菌， 近年越来越多的研究发现食源性弯曲菌的耐药也越来越严重， 不 同菌种的耐药 水平以及抗 生素耐药的种类也显著不同， 因此对于 菌种的甄别至关重要。 [0004]一直以来， 普遍认为导致弯曲菌病的主要病原是空肠弯曲菌。 但近年随着检测技 术的提高， 发现腹泻患者中结肠弯曲菌以及其它菌种的弯曲菌的感染也越来越多， 而且由 于不同菌种的耐药特征、 宿 主来源也不完全相同， 给散发及暴发感染的溯源带来困难。 菌种 识别是病原溯源的必 要手段， 基于特异靶标的菌种快速识别技术对于食源性弯曲菌感染的 防控具有重要意 义。 [0005]分离培养一直是细菌感染及污染确定 的“金标准”。 但弯曲菌体外培养生长缓慢、 需要营养丰富的培养基以及微需氧的特殊气 体环境。 随着样品及环境中非目标菌抗药性增 加， 给现行的通过培养基中添加抗生素的 “选择性”培养更加困难。 检出率低， 且很难通过培 养的手段获得不同菌种的鉴别。 传统的菌种鉴别方法主要通过选择性增菌、 多种生化反应 鉴定等过程， 操作繁琐， 费时费力且灵敏度不高。 并且生化特征对于菌种生长状态的要求比 较严格， 对于一些生化反应后颜色变化的判断不具备很好的客观性， 增加了判断错误的可 能性， 难以适应现代快速简便检测的要求。 [0006]基于特异靶标的识别是病原检测及甄别的有效手段。 并且， 当前弯曲菌新菌种的 确定也多是通过菌种 特异的遗传特征确定。 因此， 建立在菌种 特异的分子靶标基础上 的快 速检测技术是甄别病原的有效手段。 PCR技术是通用的快速分子检测技术， 传统的PCR技术 检测成本较低， 但是需要扩增后进一 步电泳确定扩增的片段， 费时且不能进行定量的分析。 [0007]由此可见， 现有的弯曲菌PCR检测技 术存在操作繁琐、 检测效率低的问题。说　明　书 1/30 页 3 CN 114606328 A 3