(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210281976.5 (22)申请日 2022.03.22 (71)申请人 北京中瑞恒达科技有限公司 地址 102200 北京市昌平区城北街道南关 路西广武路北8号楼 203 (72)发明人 刘国栋　聂艳妮　 (74)专利代理 机构 北京世衡知识产权代理事务 所(普通合伙) 11686 专利代理师 肖淑芳 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 检测粪便中幽门螺杆菌的引物和探针及其 试剂盒 (57)摘要 本发明通过对幽门螺杆菌特异 基因的比对， 提供了用于从粪便中检测幽门螺杆菌的实时荧 光定量PCR引物和探针， 其核苷酸序列分别如SEQ   ID NO:1， SEQID  NO:2， SEQ ID NO:3所示， 本发明 还提供了粪便中幽门螺杆菌进行定量检测的方 法和检测试剂盒。 本发明的检测方法具有检测准 确， 灵敏度高、 特异性强， 简便快速的优点， 具有 良好的标本 检测能力。 权利要求书1页 说明书7页 附图2页 CN 114540520 A 2022.05.27 CN 114540520 A 1.一种用于从粪便中检测幽门螺杆菌(Helicobacter  pylori， HP)的实时荧光PCR的特 异性引物。 2.根据权利要求1所述的引物， 其核苷酸序列为： HP alpB‑FP:5’ ‑AACCCATGGCTTGGGAATTT‑3’， HP alpB‑RP:5’ ‑CCAAAGAATTGCTTATAACCGATTTTA‑3’。 3.与权利要求1或2所述引物配合使用的荧 光探针。 4.根据权利要求3所述的荧 光探针， 其核苷酸序列为： (FAM)5’ ‑CAGCTCTCA AGTGAATGCGTTTAACGGG‑3’(BHQ1)。 5.一种粪便中幽门螺杆菌检测的方法， 其特征在于， 以样品总DNA为模板， 以权利要求1 或2所述的引物和权利要求3或4所述的探针进行实时荧光定量PCR， 根据扩增曲线判定结 果。 6.如权利要求5所述的幽门螺杆菌的检测方法， 其特征在于， 实时荧光定量PCR的反应 体系为 7.根据权利要求5或6所述的方法， 其特征在于， 所述实时荧光定量PCR的反应程序为： 37℃去污染2min， 37℃去污染2min， 95℃预变性10min， 1个循环； 95℃变性10s， 60℃退火 30s， 45个循环。 8.含有权利要求1或2所述引物和/或权利要求3或4所述探针的试剂盒。 9.根据权利要求8所述的试剂盒， 其还包括： 荧光定量反应液、 阴性模板和阳性模板， 所 述阴性模板为去核酸水， 所述阳性模板为0.364fg/μl～3.64ng/μl的幽门螺杆菌基因组 DNA。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114540520 A 2检测粪便中幽门螺杆菌的引物和探针及其试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及分子生物学领域， 特别是涉及用于从粪便中检测幽门螺杆菌的荧光定 量PCR引物和探针， 本发明还涉及利用所述引物和探针序列从粪便中检测幽门螺杆菌的方 法和试剂盒。 背景技术 [0002]幽门螺杆菌(Helicobacter  pylori， HP)是引起消化系统疾病的最重要的感染因 子， 与胃部多种疾病相关， 比如胃炎、 胃溃疡、 MALT淋巴瘤和胃癌， 它是世界卫生组织(WHO) 癌症协会规定的第I类致癌因子 。 [0003]幽门螺杆菌感染诊断有多种方法， 分为无创检测方法和有创的检测方法。 比如细 菌分离培养、 血清学、 快速尿素酶试验、 尿素呼气试验。 这些方法各有利弊。 分离培养方法技 术难度大， 耗时耗力。 血清学方法不能很好的证明是不是正在感染。 快速尿素酶必须依赖胃 镜， 同时市场上的试剂的结果一致性不够好。 现在用的最多的就是尿素呼气试验， 其灵敏度 和特异性受到认可， 然而其检测 所用13C或者14C尿素原料要求高， 价格高， 再加 上其检测通 量受限， 进一步限制了其在大规模人群筛查中的可行性。 从幽门螺杆菌防控的角度看， 未来 需要一种无创的， 并且具备高通量检测能力， 具备国内 自主知识产权的检测方法。 从技术角 度出发， 最合适的方法就是以粪便为标本的实时荧光PCR的方法。 人类的胃黏膜细胞每2～3 日有部分脱落更新， 胃黏膜上的幽门螺杆菌也会随之脱落， 最后随粪便排出体外。 因此在粪 便中检测幽门螺杆菌是非常可行的。 近年来， 实时荧光PCR由于其良好的灵敏度和特异性， 越来越广泛的应用于临床传染病检测。 [0004]目前有多篇文献报道了幽门螺杆菌 实时荧光PC R的检测方法， 其靶基因主要有16S   rDNA， 23S  rDNA， cagH等(参考文献 ①Rike Syahniar,Mardiastuti  H Wahid,Ari  Fahrial  Syam,et al.Detecting  the Helicobacter  pylori 16S rRNA Gene in Dyspepsia   Patients Using Real‑Time PCR.[J]Acta  Med Indones.2019  Jan； 51(1):34 ‑41.②石建 玲,程波,刘珊,et  al.基于TaqMan探针的幽门螺杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立, [J]中国实验诊断学,2 013,17(6),986 ‑989.③刘国栋.基于胃黏膜多重Real  time PCR的幽 门螺杆菌根除药物选择技术的建立与评价[D].中国疾病预防控制中心,2011.)。 这些方法 主要针对胃黏膜标本或者已经分离到的菌株， 众所周知， 胃黏膜中的幽门螺杆菌含量远远 高于粪便， 所以之前文献发表的引物和探针灵敏度不能达到直接在粪便种检测幽门螺杆菌 的需求。 [0005]综上所述， 幽门螺杆菌感染的检测发展方向必定是无创、 快速、 高通量。 针对这种 情况， 我们开发了一种用于粪便幽门螺杆菌检测的实时荧 光PCR技术。 发明内容 [0006]本发明的目的在于提供用于粪便中幽门螺杆菌检测的实时荧光PCR的特异性引物 和探针； 本发明目的还在于提供上述引物和探针的用途， 以实现从粪便中检测幽门螺杆菌说　明　书 1/7 页 3 CN 114540520 A 3