(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210281690.7 (22)申请日 2022.03.21 (71)申请人 广州尔立简生物科技有限公司 地址 510010 广东省广州市天河区广州大 道北520号自编10 5房自编D13 5号 (72)发明人 陈斌　钟玙沄　 (74)专利代理 机构 广州市越秀区哲力专利商标 事务所(普通 合伙) 44288 专利代理师 骆志豪 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于血浆游离DNA甲基化检测肠癌的引 物探针组合物及其应用和试剂盒 (57)摘要 一种用于血浆游离DNA甲基化检测肠癌的引 物探针组合物及其应用和试剂盒， 涉及体外检测 技术领域； 包括用于检测SDC2、 COL4A2、 PDX1和 NPY基因甲基化的引物对和探针。 发明的引物探 针组合物， 其可实现SDC2、 COL4A2、 PDX1和 NPY基 因甲基化特异性扩增检测， 上述基因组合的甲基 化情况可用作肠癌恶性程度和预后评价的分子 生物学标记， 实现肠癌的筛查， 准确性高。 权利要求书2页 说明书11页 序列表3页 附图5页 CN 114959025 A 2022.08.30 CN 114959025 A 1.一种用于血浆游离DNA甲基化检测肠癌的引物探针组合物， 其特征在于， 包括用于检 测SDC2、 COL4A2、 PDX1和NPY基因甲基化的引物对和探针； 用于检测SDC2基因甲基化的引物对序列如SEQ  ID NO:1和SEQ  ID NO:2所示， 探针序列 如SEQ ID NO:3所示； 用于检测COL4A2基 因甲基化的引物对序列如SEQ  ID NO:4和SEQ  ID NO:5所示， 探针序 列如SEQ ID NO:6所示； 用于检测PD X1基因甲基化的引物对序列如SEQ  ID NO:7和SEQ ID NO:8所示， 探针序列 如SEQ ID NO:9所示； 用于检测 NPY基因甲基化的引物对序列如SEQ  ID NO:10和SEQ  ID NO:11所示， 探针序 列如SEQ ID NO:12所示。 2.如权利要求1所述的用于血浆游离DNA甲基化检测肠癌的引物探针组合物， 其特征在 于： 用于检测SDC2、 COL4A2、 PDX 1和NPY基因甲基化的探针的5 ’端分别标记有FAM、 VIC、 ROX和 HEX荧光基团中的任一种； 其3 ’端分别标记有MGB、 BHQ淬灭基团的任一种。 3.一种权利要求1或2所述的用于血浆游离DNA甲基化检测肠癌的引物探针组合物在制 备多基因靶点检测肠癌试剂中的应用。 4.一种用于血浆游离DNA甲基化检测肠癌的试剂盒， 其特征在于： 包括裂解液、 荧光定 量反应液和亚硫酸氢盐转化剂， 所述荧光定量反应液包括权利要求 1或2所述的用于血浆游 离DNA甲基化检测肠癌的引物探针组合物。 5.如权利要求4所述的用于血浆游离DNA甲基化检测肠癌的试剂盒， 其特征在于： 所述 荧光定量反应液还 包括内参基因的引物及探针。 6.如权利要求5所述的用于血浆游离DNA甲基化检测肠癌的试剂盒， 其特征在于： 所述 内参基因为GAPDH， 所述内参基因的引物对序列如SEQ  ID NO:13和SEQ  ID NO:14所示， 探针 序列如SEQ  ID NO:15所示。 7.如权利要求6所述的用于血浆游离DNA甲基化检测肠癌的试剂盒， 其特征在于： 所述 荧光定量反应液包括第一 荧光定量反应液和第二 荧光定量反应液； 所述第一荧光定量反应液包括： 用于检测SDC2、 COL4A2和PDX1基因甲基化的引 物对和 探针及内参基因的引物对和探针； 所述第二荧光定量反应液包括： 用于检测NPY基因甲基化的引物对和探针及内参基因 的引物对和探针。 8.如权利要求7所述的用于血浆游离DNA甲基化检测肠癌的试剂盒， 其特征在于： 所述 第一荧光定量反应液中引物对和探针的终浓度为8 0‑100 μM； 所述第二荧光定量反应液中引 物对和探针的终浓度为 40‑50 μM。 9.一种权利要求4 ‑8任一项所述的用于血浆游离DNA甲基化检测肠癌的试剂盒， 其特征 在于， 所述试剂盒的使用方法包括以下步骤： 1)收集血浆样本， 并从所述血浆样本中提取游离DNA； 2)将所述游离DNA用亚硫酸氢盐转 化剂进行转 化， 得到bis ‑DNA； 3)将所述bis ‑DNA进行荧 光定量PCR扩增反应， 检测荧 光信号并判定结果。 10.如权利要求9所述的用于血浆游离DNA甲基化检测肠癌的试剂 盒， 其特征在于： 步骤 3)中， PCR扩增的程序为： 第一步为温度93 ‑97℃， 时间4 ‑6min， 循环1次； 第二步为温度93 ‑97权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114959025 A 2℃， 时间14 ‑16s后， 温度63 ‑65℃， 时间28 ‑32s， 循环18 ‑22次； 第三步为温度93 ‑97℃， 时间9 ‑ 11s， 循环38 ‑42次后， 温度5 6‑60℃， 时间3 0‑32s， 采集 荧光。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114959025 A 3