(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210278164.5 (22)申请日 2022.03.21 (71)申请人 隋云鹏 地址 100078 北京市丰台区芳群园3区13号 楼 (72)发明人 隋云鹏　彭双红　 (74)专利代理 机构 北京北新智诚知识产权代理 有限公司 1 1100 专利代理师 张晶 (51)Int.Cl. C12N 15/113(2010.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/85(2006.01) C12N 15/90(2006.01) C12N 9/22(2006.01)A61K 31/7088(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 35/02(2006.01) A61P 25/28(2006.01) A61P 25/16(2006.01) A61P 25/14(2006.01) A61P 25/00(2006.01) (54)发明名称 用于基因编辑的RNA框架和基因编辑方法 (57)摘要 本发明提供一种用于基因编辑的RNA框架及 基因编辑方法， 该RNA框架沿5 ′ →3′方向包括靶 位点上游序列、 待插入序列、 靶位点下游序列。 该 基因编辑方法基于真核生物自身的固有机制， 以 RNP或RNA(可体外制备产生)及相关蛋白质为载 体， 转入细胞质及细胞核， 实现对目标体系基因 组上特定序列或位点的基因编辑， 如特定序列的 插入、 删除、 替换及位点替换等， 同时兼具较高的 靶向准确性。 本发明因不引入外源性体系或物质 如源自原核生物的蛋白质等 以及不产生双链断 裂等， 所以较其他现有技术更适于进一步临床应 用。 权利要求书6页 说明书75页 序列表19页 附图5页 CN 115044583 A 2022.09.13 CN 115044583 A 1.一种用于基因编辑的RNA框架， 其特征在于， 该RNA框架沿5 ′ →3′方向包括靶位点上 游序列、 待插 入序列、 靶位 点下游序列； 该RNA框架上的靶位点上游序列或该靶位点上游序列的互补序列用于与真核生物基因 组或原核生物基因组中靶位点的靶位点的上游序列或靶位点的上游序列的互补序列杂交， 该RNA框架上的靶位点下游序列或靶位点下游序列的互补序列用于与真核生物基因组或原 核生物基因组中靶位点的靶位点的下游序列或靶位点的下游序列的互补序列杂交； 该RNA 框架上的该靶位点上游序列和该靶位点下游序列在基因组中的对应序列中为直接相连； 基 因组上序列中的靶位 点的上游序列和靶位 点的下游序列之间为靶位 点。 2.如权利要求1所述的用于基因编辑的RNA框架， 其特征在于， 所述的用于基因编辑的 RNA框架进一步包括： 在所述靶位点下游序列的下游 直接或间接连接一 或多个ORF2p功能起 始部分； 或将所述的用于基因编辑的RNA框架的所述靶位点下游序列替换或部分替换为一 或多个ORF2p功能起始部分； 其中， 多个该ORF2p功能起始部分之间直接或间接连接 。 3.如权利 要求2所述的用于基因编辑的RNA框架， 其特征在于， 在所述ORF2p功能起始部 分的内部进一步插入一 或多个泛ORF1p编码序列和/或一或多个泛ORF2p编码序列； 其中， 当 所述ORF2p功能起始部分内插入的为一个泛ORF1p编码序列或一个泛ORF2p编码序列时， 该 ORF2p功能起始部分与该泛ORF1p编码序列或泛ORF2p编码序列直接或间接连接； 当所述 ORF2p功能起始部分内插入的为a)多个泛ORF1p编码序列， 或b)多个泛ORF2p编码序列， 或c) 泛ORF1p编码序列和 泛ORF2p编码序列的数量之和大于或等于二时， 泛ORF1p编码序列与泛 ORF2p编码序列之间直接或间接连接、 泛ORF1p编码序列之间直接或间接连接、 泛ORF2p编码 序列之间直接或间接连接、 该ORF2p功能起始部分与该泛ORF1p编码序列或泛ORF2p编码序 列直接或间接连接 。 4.如权利 要求1所述的用于基因编辑的RNA框架， 其特征在于， 所述RNA框架进一步包括 在该靶位点上游序列的上游、 和/或该靶位点上游序列的内部、 和/或该靶位点下游序列的 内部、 和/或该靶位点下游序列的下游直接或间接连接一或多个泛ORF1p编码序列和 /或一 或多个泛ORF2p编码序列。 5.如权利 要求4所述的用于基因编辑的RNA框架， 其特征在于， 当所述一或多个泛ORF1p 编码序列和/或一或多个泛ORF2p编码序列位于该靶位点上游序列的上游、 该靶位点上游序 列的内部、 该靶位点下游序列的内部、 该靶位点下游序列的下游时， 且同一位置的a)多个泛 ORF1p编码序列的数量之和大于或等于二、 或b)多个泛ORF2p编码序列的数量之和大于或等 于二、 或c)泛ORF1p编码序列和泛ORF2p编码序列的数量之和大于或等于二时， 泛ORF1p编码 序列与泛ORF2p编码序列之间直接或间接连接、 泛ORF1p编码序列之间直接或间接连接、 泛 ORF2p编码序列之间直接或间接连接 。 6.如权利要求4所述的用于基因编辑的RNA框架， 其特征在于， 所述的用于基因编辑的 RNA框架进一步包括在该靶位点下游序列的下游直接或间接连接一或多个ORF2p功能起始 部分。 7.如权利 要求6所述的用于基因编辑的RNA框架， 其特征在于， 当所述一或多个泛ORF1p 编码序列和/或一或多个泛ORF2p编码序列位于靶位点上游序列的上游、 靶位点上游序列的 内部、 靶位点下游序列的内部时， 且同一位置的a)多个泛ORF1p编码序列的数量之和大于或 等于二、 或b)多个泛ORF2p编码序列的数量之和大于或等于二、 或c)泛ORF1p编码序列和 泛权　利　要　求　书 1/6 页 2 CN 115044583 A 2ORF2p编码序列的数量之和大于或等于二时， 泛ORF1p编码序列与泛ORF2p编码序列之间直 接或间接连接、 泛ORF1p编码序列之间直接或间接连接、 泛ORF2p编码序列之间直接或间接 连接。 8.如权利 要求6所述的用于基因编辑的RNA框架， 其特征在于， 当所述一或多个泛ORF1p 编码序列和/或一或多个泛ORF2p编码序列位于靶位 点下游序列的下游时： a)当存在一或多个ORF2p功能起始部分和一或多个泛ORF1p编码序列时， 该一或多个 ORF2p功能起始部分位于该一或多个泛ORF1p编码序列之前或之后， 或ORF2p功能起始部分 与泛ORF1p编码序列间隔排列， 该ORF2p功能起始部分和该泛ORF1p编码序列之间直接或间 接连接， 多个该泛ORF1p编码序列之间直接或间接连接， 多个该ORF2p功能起始部分之间直 接或间接连接； 或 b)当存在一或多个ORF2p功能起始部分和一或多个泛ORF2p编码序列时， 该一或多个 ORF2p功能起始部分位于该一或多个泛ORF2p编码序列之前或之后， 或ORF2p功能起始部分 与泛ORF2p编码序列间隔排列， 该ORF2p功能起始部分和该泛ORF2p编码序列之间直接或间 接连接， 多个该泛ORF2p编码序列之间直接或间接连接， 多个该ORF2p功能起始部分之间直 接或间接连接； 或 c)当存在一或多个ORF2p功能起始部分、 一或多个泛ORF1p编码序列和一或多个泛 ORF2p编码序列时， 该ORF2p功能起始部分位于该一 或多个泛ORF1p编码序列之前或之后、 或 该一或多个泛ORF2p编码序列之前或之后、 或该一 或多个泛ORF1p编码序列位于该一 或多个 泛ORF2p编码序列之前或之后， 或该ORF2p功能起始部分、 该泛ORF1p编码序列和/或该泛 ORF2p编码序列间隔排列； 该ORF2p功能起始部分和该泛ORF1p编码序列之间直接或间接连 接， 该ORF2p功能起始部分和该泛ORF2p编码序列之间直接或 间接连接， 多个该泛ORF1p编码 序列之间直接或间接连接； 多个该泛ORF2p编码序列之间直接或间接连接， 多个该ORF2p功 能起始部分之间直接或间接连接， 该泛ORF1p编码序列和该泛ORF2p编码序列之间直接或间 接连接。 9.如权利 要求6‑8任一项所述的用于基因编辑的RNA框架， 其特征在于， 所述RNA框架中 的一或多个ORF2p功能起始部分其中单个ORF2p功能起始部分内部进一步直接或间接连接 一或多个泛ORF1p编码序列和/或一或多个泛ORF2p编码序列时， 其中， 当所述ORF2p功能起 始部分内插入的为一个泛ORF1p编码序列或一个泛ORF2p编码序列时， 该ORF2p功能起始部 分与该泛ORF1p编码序列或泛ORF2p编码序列直接或间接连接； 当所述ORF2p功能起始部分 内插入的为a)多个泛ORF1p编码序列， 或b)多个泛ORF2p编码序列， 或c)泛ORF1p编码序列和 泛ORF2p编码序列的数量之和大于或等于二时， 泛ORF1p编码序列与泛ORF2p编码序列之间 直接或间接连接、 泛ORF1p编码序列之间直接或间接连接、 泛ORF2p编码序列之间直接或间 接连接、 该ORF2p功能起始部分与该泛ORF1p编码序列或泛ORF2p编码序列直接或间接连接 。 10.如权利要求4 ‑9任一项所述的用于基因编辑的RNA框架， 其特征在于， 所述RNA框架 中的靶位点下游序列替换或部分替换为一或多个ORF2p功能起始部分； 其中， 当为多个该 ORF2p功能起始部分时， 各 该ORF2p功能起始部分之间直