(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210271728.2 (22)申请日 2022.03.18 (71)申请人 中国水产科 学研究院北戴河中心实 验站 地址 066199 河北省秦皇岛市北戴河区金 山路七号 (72)发明人 张晓彦　侯吉伦　王桂兴　韩甜　 刘玉峰　何忠伟　王玉芬　 (74)专利代理 机构 北京超凡宏宇专利代理事务 所(特殊普通 合伙) 11463 专利代理师 姚大雷 (51)Int.Cl. C12N 15/113(2010.01) C12N 9/22(2006.01) C12N 15/11(2006.01)C12N 15/873(2010.01) C12N 15/53(2006.01) C12N 15/89(2006.01) A01K 67/027(2006.01) A61K 49/00(2006.01) C12Q 1/6888(2018.01) (54)发明名称 斑马鱼排卵障碍模型的构建方法、 检测方法 及应用 (57)摘要 本发明提供了斑马鱼排卵障碍模型的构建 方法、 检测方法及应用， 涉及基因工程技术领域。 本发明提供了用于特异性敲除斑马鱼cyp21a2 基 因的sgRNA， 通过CRISPR/Cas9技术构建并选育出 cyp21a2基因缺失型斑马鱼， 获得了斑马鱼排卵 障碍模型。 本发 明所构建的斑马鱼排卵障碍模型 同时具备高雄激素和 高促黄体激素的内分泌特 征， 为深入解析内分泌激素调控排卵机制研究提 供了良好的模型 材料。 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图3页 CN 114774413 A 2022.07.22 CN 114774413 A 1.用于斑马鱼cyp21a2基因敲除的sgRNA， 其特征在于， 所述sgRNA的DNA序列为SEQ  ID  No.1和SEQ ID No.2所示。 2.一种CRISPR/Cas9组合物， 其特征在于， 所述组合物包含权利要求1所述的sgRNA或编 码权利要求1所述sgRNA的DNA， 以及Cas9蛋白。 3.权利要求1所述的sgRNA或权利要求2所述的CRISPR/Cas9组合物在制 备斑马鱼排卵 障碍模型 的应用； 优选地， 所述应用为在构建斑马鱼高雄激素和高促黄体激素不孕模型中 的应用。 4.一种cyp21a2基因功能缺失的斑马鱼突变体的制备方法， 其特征在于， 所述方法包 括： (a)将权利要求1所述的sgRNA和Cas9蛋白共同导入斑马鱼受精卵中； (b)培养获得稳定遗传的cyp21a2基因功能缺失的斑马鱼突变 体。 5.根据权利要求4所述的制备方法获得的斑马鱼基因突变体， 其特征在于， 斑马鱼 cyp21a2基因第二外 显子上46bp片段被敲除， 被敲除的序列如SEQ  ID No.5所示。 6.一种斑马鱼排卵障碍模型的构建方法， 其特 征在于， 所述方法包括以下步骤： (A)设计并合成用于靶 向斑马鱼cyp21a2基因第二外显子的sgRNA； 所述sgRNA的DNA序 列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示； (B)将有活性的sgRNA和Cas9蛋白的组合物经显微注射入斑马鱼受精卵中； (C)培育显微注射后的受精卵， 获得F0代斑马鱼， 将阳性斑马鱼与野生型杂交， 得到F1 代杂合子， 自交， 得到F2 代纯合突变体， 即得斑马鱼排卵障碍模型。 7.根据权利要求6所述的构建方法， 其特征在于， 所述方法还包括将得到的F2代纯合突 变体培养至成鱼， 选出雌鱼， 检测激素水平， 获得斑马鱼高雄激素和高促黄体生激素不孕模 型。 8.根据权利要求6或7所述的构建方法， 其特征在于， 所述sgRNA和Cas9蛋白的组合物 中， sgRNA的终浓度为80 ‑150ng/ μL； C as9蛋白终浓度为200 ‑300ng/ μL； 优选地， 每个受精卵 注射所述组合物的体积为0.8 ‑1.2nL。 9.用于检测权利要求6 ‑8任一项所述的构建方法得到的斑马鱼模型的引物序列， 其特 征在于， 所述引物序列如SEQ  ID No.3和SEQ ID No.4所示。 10.权利要求6 ‑8任一项所述构建方法得到的斑马鱼模型在排卵障碍相关的疾病的药 物研究或药物筛 选中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114774413 A 2斑马鱼排卵障碍模型的构建 方法、 检测方 法及应用 技术领域 [0001]本发明涉及基因工程技术领域， 尤其是涉及斑马鱼排卵障碍模型的构建方法、 检 测方法及应用。 背景技术 [0002]排卵障碍包括稀发排卵和无排卵， 占不孕症患者病因的25％， 其病因复杂， 准确定 位及评估排卵障碍发病机制是有效治疗的关键(闫阳等， 2021)。 内分泌失调是多种排卵障 碍的主要表现， 包括以高雄激素为特征 的多囊卵巢综合征， 和以高促黄体激素为特征 的卵 巢不敏感综合征(Ruan  X等， 2018； Manna  PR等， 2016和Zh ang Y等， 2018)。 这些疾病的发病 机制复杂， 涉及途径繁多， 因此， 不孕模型的成功构建为明确该类疾病的致病原因、 早期诊 断和治疗奠定 了基础。 [0003]cyp21a基因定位于人类6p21.3， 有真基因和假基因两个基因组成。 cyp21a基因为 编码21羟化酶 的功能基因， 该酶催化17 ‑羟孕酮(17 ‑OHP)转化为11 ‑脱氧皮质醇， 同时催化 孕酮转化为11‑脱氧皮质酮， 二 者分别是皮质醇和醛固酮的前体。 [0004]21羟化酶活性降低致使皮质醇和醛固酮合成受损， 最终导致高雄激素血症， 临床 上表现为女性男性化、 不育等症状(例如先天性肾上腺皮质增生症， CAH)。 目前， 为了研究 由 cyp21a基因突变引起的CAH即先天性肾上腺皮质增生症21羟化 酶缺乏型(21OHD)， 人们构建 了21OHD老鼠模型和利用TALEN法构建的cyp21a基因突变斑马鱼模型(TOSHIHIRO  TAJIMA 等， 1999； M  Perdomini等， 2017和Helen  Eachus等， 2017)， 而老鼠模型存在很难养活的问 题， 斑马鱼模 型存在尚未出现排卵障碍性状的问题。 因此， 有必 要继续研究和开 发cyp21a基 因突变相关的排卵障碍模型， 为 排卵障碍发病机制的研究提供基础。 [0005]鉴于此， 特提出本发明。 发明内容 [0006]本发明的目的在于提供一种高LH和T激素内分泌特征的排卵障碍模型的构建方 法、 检测方法及应用。 本发明提供了用于特异性敲除斑马鱼cyp21a2基因的sgRNA， 通过 CRISPR/Cas9技术构建并选育出cyp21a2基因缺失型斑马 鱼， 获得了斑马 鱼排卵障碍模型。 本发明所构建的斑马鱼排卵障碍模 型同时具备高雄激素(T)和高促黄体激素素(LH)的内分 泌特征， 为深入解析内分泌激素调控排卵机制研究提供了良好的模型 材料。 [0007]本发明提供的技 术方案如下： [0008]在一个方面， 本发明提供了用于斑马鱼cyp21a2基因敲除的sgRNA， 所述sgRNA的 DNA序列为SEQ  ID No.1和SEQ ID No.2所示。 [0009]本发明中提供的sgRNA是基于CRISPR/Cas9技术， 特异性敲除斑马鱼cyp21a2基因 构建斑马鱼排卵障碍模型的sgRNA。 [0010]在另一个方面， 本发明提供了一种CRISPR/Cas9组合物， 所述组合物包含前述 sgRNA或编码权利要求1前述sgRNA的DNA， 以及Cas9蛋白。说　明　书 1/7 页 3 CN 114774413 A 3