(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210265836.9 (22)申请日 2022.03.17 (71)申请人 吕梁市农业农村局 地址 033099 山西省吕梁市离石区国投财 经中心D座13层 申请人 山西省植物保护植物检疫总站 　 柳林县农业农村局 (72)发明人 高晓勋　刘一景　孙凌　贾彦生　 (74)专利代理 机构 北京盛凡佳华专利代理事务 所(普通合伙) 11947 专利代理师 孙莉莉 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种鉴定甜菜 筒喙象特异引物对及其应用 (57)摘要 本发明提供了一种用特异性PCR引物检测甜 菜筒喙象的分子鉴定方法。 该方法利用RAPD技术 获得甜菜筒喙象特异序列， 并设计高效PCR扩增 引物， 建立与之相辅PCR检测体系， 快速获得甜菜 筒喙象特有22 3bp单一的DNA条带。 该方法具有操 作方便、 鉴定准确等优点， 可实现对甜菜筒喙象 的快速分子鉴定， 加快对该害虫检测以及针对性 防治的反应 速度。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图1页 CN 114480677 A 2022.05.13 CN 114480677 A 1.一种检测甜菜筒喙象的特异性引物对， 其特征在于， 由SEQ  ID NO： 1所示的上游引物 和SEQ ID NO： 2所示的下游引物组成。 2.一种用特异性引物对检测甜菜筒喙象的PCR方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： (1)待测样品DNA的提取； (2)以所述待测样品的DNA为模板， 采用权利要求1所述的特异性引物对DNA模板进行 PCR扩增； (3)对上述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测， 根据电泳检测结果判定样品中DNA模板 是否来源于甜菜筒喙象； 若电泳结果显示在223bp 处有单一DNA条带， 则 该样品为甜菜筒喙 象； 若未扩增出2 23bp的序列片段， 则样品为 其它物种。 3.如权利要求2所述检测甜菜筒喙象的PCR方法， 其特征在于， 所述PCR的反应体系： 待 测样品DNA  1 μL； 上游引物0.5 μL； 下游引物0.5 μL； 2 ×Taq PCR MasterMixⅡ12.5 μL； 无菌 水 10.5 μL。 4.如权利要求2所述检测甜菜筒喙象的方法， 其特征在于， 所述PCR的反应条件： 95℃ 3min； 95℃30s， 61℃3 0s； 72℃20s， 共40个 循环； 72℃2mi n， 4℃保存PCR产物。 5.如权利要求3所述PCR的反应体系， 其特征在于， 上游引物和下游引物 的摩尔浓度为 10 μM。 6.如权利要求3所述PCR的反应体系， 其特征在于， 待测样品DNA的浓度不小于250pg/μ L。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114480677 A 2一种鉴定甜菜筒喙象特异引物对及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及生物技术领域， 特别涉及一种甜菜筒喙象特异引物及其快速鉴定方 法。 背景技术 [0002]甜菜筒喙象Lixus  subtilis  Boheman， 属于鞘翅目象甲科， 又名甜菜茎象甲， 在我 国主要为害甜菜， 亦可为害藜科、 蓼科、 苋科的一些野生杂草。 藜麦Chenopodium  quinoa  Willd， 藜 科藜属， 原产于南美洲的安第斯山区。 由于其富含矿物质、 维生素、 脂肪酸等， 可降 低罹患各种疾病的风险， 被列为全球10大健康营养食品之一， 具有极高的经济价值。 近年 来， 藜麦在我国广泛引进种植， 成为地方县市的支柱产品。 随着藜麦种植的广泛开展， 甜菜 筒喙象逐渐成为藜麦的主要虫害。 甜菜筒喙象为蛀茎害虫， 成虫可在藜麦茎秆底部打孔并 将卵产于植物组织中， 孵化幼虫蛀空茎秆， 严重影响营养输送， 同时致使主茎易风折， 植株 成片倒伏， 造成藜麦严重减产。 甜菜筒喙象为害极为隐蔽， 一旦发生极难挽 回经济损失。 因 此对其防治主要以预防为主， 需在播种 前对地块害虫进行鉴定及针对性的布防。 目前对甜 菜筒喙象的种类鉴定， 主要依靠成虫 的外部形态学特征进行。 这需要具备相关昆虫分类知 识的专业人员以及专业的显微设备才能鉴别。 加之而 田间环境复杂， 多种 形态的甜菜筒喙 象共存， 如卵、 幼虫、 蛹及成虫等， 加大了形态学鉴定的难度。 需要甜菜筒喙象的快速准确鉴 定方法的建立。 [0003]随着分子生物学的快速发展， 分子方法在鉴定昆虫中有较多的应用。 该类方法不 受环境、 害 虫样本及人为因素的影响， 具有较高的特异性和准确性。 目前应用较为广泛的技 术为DNA条形码(DNA  Barcoding)， 即利用线粒体细胞色素氧化酶亚基 Ⅰ基因(cox1)5 ’端 658bp的序列作为分类的依据。 该技术需要一定的昆虫线 粒体基因组信息作为支撑， 并且需 要对样品DNA进 行测序比对， 对于大规模的鉴定经济负担重且周期 长。 此外鉴定的结果准确 性还受到假基因、 母系 遗传等干扰， 需要辅以其他分子鉴定方法。 RAPD(random  amplified   polymorphic  DNA)即随机扩增 多态性DNA技术， 该方法通过人工合成的随机引物对物种的 基因组DNA的进行PCR(Polymerase  Chain Reaction)， 以得到不同的带谱， 对于某一特定物 种中出现的特异条带就可作为该模板的分子标记。 RAPD具有 无需知道被研究生物基因组的 信息的优势， 现已应用于生物的品种鉴定、 系谱分析及 进化关系的研究中。 但该技术也存在 PCR产物不特异、 结果不稳定、 重复性差等缺点， 给分子学鉴定带来一定的困难。 目前还需要 对改方法进行进一 步改进， 以实现甜菜筒喙象快速和准确的分子鉴定 。 发明内容 [0004]基于上述背景， 本发明的目的为： 提供一种甜菜筒喙象特异引 物对及快速鉴定方 法， 通过该特异性引物对可以实现甜菜筒喙象的快速分子鉴定 。 [0005]为了实现上述发明目的， 本发明提供以下技 术方案： [0006]本发明提供了检测甜菜筒喙象的特异性引物对， 其由SEQ  ID NO： 1所示的上游引说　明　书 1/4 页 3 CN 114480677 A 3