(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210262671.X (22)申请日 2022.03.17 (71)申请人 中国科学院北京基因 组研究所 （国 家生物信息中心） 地址 100101 北京市朝阳区北辰西路1号院 104号楼 (72)发明人 康禹　邵长君　王建　楚亚男　 陈婧　 (74)专利代理 机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 11227 专利代理师 温可睿 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/682(2018.01) C12Q 1/6834(2018.01) (54)发明名称 一种核酸检测的通用试剂 (57)摘要 本发明涉及核酸分子检测技术领域， 尤其涉 及探针组合及其应用。 本发明通过与微球连接的 核酸链之间发生的趾托介导的链置换(TMSD， Toehold‑mediated  strand displacement)反 应， 使微球形成凝集块， 至肉眼可见。 该方法不需 要复杂的操作或昂贵的设备， 无需生物酶参与， 无需扩增待测靶 标， 能够作为分子检测试剂提供 快速、 现场的定性及半定量检测。 实验表明， 本发 明设计的探针组合， 在对样品进行检测的过程 中， 能够准确识别含有靶标和不含有靶标的样 品， 灵敏度可达 到100fM。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图2页 CN 114672484 A 2022.06.28 CN 114672484 A 1.探针组合， 包括： 基于趾托介导的链置换反应的催化探针、 信号探针和燃料探针； 其 中： 催化探针靶向识别待测物， 信号探针或燃料探针的末端连接有微球； 所述微球选自纳米金、 磁珠、 聚苯乙烯微球或乳胶微球。 2.根据权利要求1所述的探针组合， 其特征在于， 所述信号探针的末端连接乳胶微球， 所述燃料探针的末端连接聚苯乙烯微球。 3.根据权利要求2所述的探针组合， 其特 征在于， 所述信号探针的末端连接 50～200nm无色乳胶微球， 所述燃料探针的末端连接 5～10 μm红色聚苯乙烯微球。 4.根据权利要求1～3任一项所述的探针组合， 其特 征在于， 所述信号探针的3 ’端与微球连接， 则所述燃料探针的3 ’端与微球连接； 所述信号探针的5 ’端与微球连接， 则所述燃料探针的5 ’端与微球连接； 所述信号探针或燃料探针与微球之间还包括隔离区片段， 所述隔离区片段为长度为15 ～25bp的po lyA或polyT。 5.根据权利要求1～3任一项所述的探针组合， 其特征在于， 所述信号探针或燃料探针 与微球连接的方式包括如下I)～I II)中任一种： I)、 探针与微球通过生物素与链霉亲和素 连接； II)、 探针与微球通过C ‑N化学键连接； III)、 探针与微球通过 金硫键连接 。 6.根据权利要求1～5任一项所述的探针组合， 其特 征在于， 所述催化探针包括 顺序连接的片段3 *、 片段2*、 片段1*和靶向识别片段； 所述信号探针包括 顺序连接的片段1、 片段2、 片段3、 片段4*、 片段3 *和片段2*； 所述燃料探针包括 顺序连接的片段3、 片段4、 片段3 *、 片段2*和片段4*； 其中， 所述靶向识别片段与待测物特异性结合， 所述片段1与片段1*反向互补， 所述片 段2与片段2*反向互补， 所述片段3与片段3 *反向互补， 所述片段4与片段4*反向互补。 7.根据权利要求6所述的探针组合， 其特 征在于， 所述片段1的核酸序列为GTCAGTGA； 所述片段2的核酸序列为GCTAG GTTA； 所述片段3的核酸序列为GATGTCG； 所述片段4的核酸序列为TCTACACATG G。 8.权利要求1～7任一项所述的探针组合在制备分子检测的试剂中的应用。 9.根据权利要求8所述的应用， 其特征在于， 所述分子检测的待测物为 能够与靶向识别 片段结合的物质， 包括： 核酸、 氨基酸、 多肽、 蛋白质、 ATP、 金属离 子、 微量元素或重金属。 10.一种分子检测试剂， 其特 征在于， 包括权利要求1～7任一项所述的探针组合。 11.根据权利要求10所述的分子检测试剂， 其特征在于， 还包括捕获探针， 所述捕获探 针与待测物特异性结合； 所述捕获探针的末端与磁珠 连接。 12.一种分子检测方法， 其特 征在于， 包括以权利要求10或1 1所述的试剂进行检测。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114672484 A 2一种核酸检测的通用试剂 技术领域 [0001]本发明涉及核酸分子检测技 术领域， 尤其涉及DNA杂交反应及其应用。 背景技术 [0002]分子诊断在健康领域具有广泛的应用， 可用于临床诊断、 传染病防控、 环境污染检 测等。 分子诊断中的核酸诊断， 即检测待检物中是否含有特定序列的核酸， 使用最为广泛。 各种特定序列的核酸诊断标志物是疾病诊断的重要依据。 现有的诊断方法主要依赖酶介导 的核酸片段的扩增， 如PCR、 以及LAMP、 NASBA等等温扩增反应， 往往受到低温储存、 运输， 以 及酶制备成本的 限制， 价格相对较高， 尤其是依赖荧光检测的核酸扩增反应， 需要 特殊的设 备条件， 进一 步提高成本， 而且无法用于现场检测。 [0003]近年来， 无酶核酸检测越来越受到重视。 这是一类基于核酸热动力学的短D NA趾托 介导的链置 换(TMSD， T oehold‑mediated  strand displacement)反应， 包括催化发夹式DNA 组装(CHA)和杂交链式反应(HCR)等。 基本原理是使用发夹DNA在检测 靶标的触发下打开发 卡结构， 然后与系统中的其他发卡探针通过自发的链置换反应装配成杂交复合物。 发夹复 合体结合荧光检测技术、 颜色反应或电化学传感器， 可以检测 到杂交复合物， 实现目标DNA 的检测。 这些方法可以实现待检物的定量， 但也需要复杂的设备和检测系统， 难以用于 没有 检测条件的现场环境。 发明内容 [0004]有鉴于此， 本发明要解决的技术问题在于提供与微球偶联的TMSD反应的探针组合 及其应用， 该核酸探针微球复合物 能够实现肉眼观测结果， 实现现场环境下 的定性及半定 量检测。 [0005]本发明提供的探针组合， 包括： 基于TMSD反应的催化探针、 信号探针和燃料探针； 其中： [0006]催化探针靶向识别待测物， [0007]信号探针或燃料探针的末端连接有微球； [0008]所述微球选自纳米金、 磁珠、 聚苯乙烯微球或乳胶微球。 [0009]本发明中， 所述信号探针或燃料探针与微球偶联， 且微球上的探针密度足够高， 探 针之间的杂交反应可以将多个微球连在一起， 形成微米级核酸 ‑微球复合物， 使肉眼可见 (反应原理如图1)。 为了方便观察和区分， 本发明所述微球可为无色或带有颜色， 例如可为 红色、 白色、 黄 色、 蓝色等。 通过上述简单的步骤， 本发 明提供的信号放大方法， 操作简单， 不 需要对检测目标进 行标记， 无需酶催 化的扩增反应， 可在室温条件下自发进行， 肉眼可观测 结果， 无需检测设备， 从而 有效降低检测成本 。 [0010]本发明实施例中， 所述信号探针末端连接的微球和燃料探针末端连接的微球的材 质可以相同也可不同。 一些实施例中， 所述信号探针的末端连接乳胶微球， 所述燃料探针的 末端连接聚苯乙烯微球。说　明　书 1/6 页 3 CN 114672484 A 3