(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210262449.X (22)申请日 2022.03.16 (71)申请人 郑州大学第一附属医院 地址 450052 河南省郑州市二七区建 设东 路50号 (72)发明人 任志刚　刘振国　姜炎　 (74)专利代理 机构 杭州中成专利事务所有限公 司 33212 专利代理师 朱莹莹 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6883(2018.01) C12N 15/11(2006.01) G16B 20/30(2019.01) G16B 25/20(2019.01)G16B 40/00(2019.01) (54)发明名称 一种用于癫痫患者无创诊断的口腔微生物 基因标志 物及其应用 (57)摘要 本发明属于生物医药技术领域， 具体涉及一 种用于癫痫患者无创诊断的口腔微生物基因标 志物及其应用。 本发明提供了一种用于区别癫痫 患者和健康人群的口腔微生物基因标志物(口腔 微生物模型)， 由SEQ  ID NO:1‑5所示的5种微生 物基因组成， 所述微生物基因在人体口腔中富 集。 本发明的微生物基因区别模 型在癫痫患者和 健康对照者中实现了良好的区别能力。 权利要求书1页 说明书6页 序列表3页 附图3页 CN 114959075 A 2022.08.30 CN 114959075 A 1.一种用于区别癫痫患者和健康人群的口腔微生物基因标志物， 其特征在于： 由SEQ   ID NO:1‑5所示的5种微 生物基因 组成， 所述 微生物在口腔中富 集。 2.一种用于检测权利要求1所述口腔微生物基因标志物的检测试剂， 包括用于检测权 利要求1所述的SEQ  ID NO:1‑5所示的5种微 生物基因的引物。 3.根据权利要求2所述的检测试剂， 其特 征在于： 所述引物序列为SEQ  ID NO:6‑7。 4.权利要求2所述检测试剂在制备癫痫与健康人群的区分检测试剂盒中的应用。 5.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于： 所述 区分检测试剂 盒适用于区分癫痫患 者 与健康人群。 6.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于： 对所述对象的舌拭子进行检测， 以便确定 该样本是否包含所述的微生物基因， 是否可以建立区别 癫痫患者与健康人群的微生物基因 模型。 7.根据权利要求6所述的应用， 其特征在于： 通过收集入组对象的舌拭子样本， 抽提微 生物总DNA， 完成微生物DNA的16S  rDNA Miseq测序， 检测是否存在权利要求1所述的5种微 生物基因。 8.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于： 通过收集入组对象的舌拭子样本， 抽提微 生物总DNA， 进行口腔菌群的16S  rDNA Miseq测序； 基于高通量测序数据， 在训练集中建立 癫痫患者与健康人群的微生物区别模型， 建立癫痫患病率POD指数； POD指数在验证集中计 算其区别能力， 进行验证。 9.根据权利要求 4所述的应用， 其特 征在于， 具体包括： (1)收集入组对象的舌拭子样本， 入组对象包括100例 癫痫患者和200例健康对照， 按照 DNA的标准抽提方法完成口腔样 本中微生物总DNA的抽提， 在Illumina  MiSeq平台完成口腔 菌群的16S  rDNA高通 量测序工作； (2)基于高通量测序数据， 在微生物区别模型的训练集 中， 在100例 癫痫患者和200例健 康对照者之间， 基于一个随机森林模型， 通过一个五倍交叉验证的算法， 鉴定了用于该模型 的最佳的5个微 生物基因标志 物； (3)基于5个微生物基因标志物， 通过使用随机生成的决策树的比率来计算癫痫的患病 率POD指数； (4)该微生物区别模型在100例癫痫患者和200例健康对照者之间的区别能力达到 98.85％， POD 指数在癫痫患者中 明显升高， 两组之间有显著性差； (5)在验证集 中， 该微生物区别 模型在57例 癫痫患者和101例健康对照之间的区别能力 达到98.85％； POD 指数在癫痫患者中 明显升高， 两组之间有显著性差异。 10.一种用于区别癫痫患者和健康对照者的试剂盒， 包括用于检测权利要求1所述的 SEQ ID NO:1‑5所示的5种微 生物基因的引物。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114959075 A 2一种用于癫痫患者无创诊断的口腔微生物基因标志物及其 应用 [0001]本发明属于生物医药技术领域， 具体涉及 一种用于癫痫患者无创诊断的口腔微生 物基因标志 物及其应用。 背景技术 [0002]癫痫是一种影响各个年龄人群 的慢性非传染性疾病， 全球每年大约有500万人被 诊断为该神经系统疾病(WH O)。 它的特征是具有产生癫痫发作的持久倾向， 以及因此带来的 神经生物学、 认知、 心理和社会后果。 至此， 癫痫没有容易 获得的金标准， 完整的病史和目击 者的可靠叙述是诊断的关键。 此外， 癫痫的多态 性以及各种因素也使得诊断更加复杂， 从第 一次未被识别的癫痫发作到出现癫痫发作的时间包含几周到几十年不等。 不幸的是， 癫痫 的延迟就诊和误诊并不少见， 并且具有潜在的破坏性。 因此， 找到一种全面、 可靠的筛查或 诊断方法就显的十分重要。 [0003]肠道微生物和大脑通过激 活迷走神经、 调节内分泌和免疫反应以及产生微生物代 谢物等方式相互交流。 当基因多态性、 环境刺激、 饮食变化和胃肠道紊乱等变化影响到脑 ‑ 肠轴时， 就会出现神经和精神疾病的发展。 例如， Christine  A等人的动物实验清楚地表 明 特定的肠道菌群介导了生酮饮食的抗癫痫作用， 并与全身γ ‑谷氨酸化氨基酸的减少和海 马GABA/谷氨酸水平升高相关。 同时， 多项人体研究表明相比健康人， 难治性癫痫的肠道菌 群组成发生了改变。 而口腔菌群作为一个不断补充肠道菌群的微生物库， 至少有三分之一 的口腔微生物细胞通过消 化道进入健康人 的肠道。 然而， 癫痫患者的口腔菌群特征还不清 楚。 [0004]近年来， 随着测 序技术的发展， 人们对微生物组的组成、 功能和代谢潜力与 疾病的 关系进行了广泛的研究。 肠道微生物群对各种神经发育、 神经精神和神经退行性疾病的诊 断潜力已被令人瞩目的研究证实， 但少有研究突出了癫痫患者和健康对照组的口腔微生物 群之间的区别， 口腔微生物群可能在癫痫发作中发挥重要作用， 因此可能成为药物治疗的 新靶点或生物标志 物， 口腔微 生物群对癫痫的诊断潜力有 待进一步评估。 发明内容 [0005]本发明提供了一种用于区别癫痫患者和健康人群的口腔微生物基 因标志物(口腔 微生物模 型)， 由SEQ  ID NO:1‑5所示的5种微生物基因组成， 所述微生物基因在人体口腔中 富集， 序列如下： [0006]＞OTU22 [0007]CCTACGGGTGGCTGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTgtg tgATGAAGGCCTTCGGGTTGTAAA GCACTTTTGGCGGGAACGAAAA GGACTGTGCCAATACCACGGTTCGATGACG GTACCCGCA GAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCA GCAGCCGCGGTAATACGTA GGGTGCAAGCGTTAATCGGAA TTACTGGGCGTAAA GAGTGCGCAGGCGGTTTTGCAA GACCGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCAT TGGTGACTGCAA GGCTAGAGTgtgtCA GAGGGAGGTGGAATTCCGCATGTAGCA GTGAAATGCGTA GATATGCGGA说　明　书 1/6 页 3 CN 114959075 A 3