(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210260994.5 (22)申请日 2022.03.16 (71)申请人 天根生化科技 （北京） 有限公司 地址 100192 北京市海淀区西小口路6 6号 东升科技园 （北 领地） C7- 3 (72)发明人 张双宇　刘玉方　李晓晨　孙克非　 (74)专利代理 机构 北京清亦华知识产权代理事 务所(普通 合伙) 11201 专利代理师 尚伟净 (51)Int.Cl. C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于检测Vero细胞基因组DNA的组合物、 试 剂盒及方法 (57)摘要 本发明提出了用于检测Vero细胞基因组DNA 的组合物、 试剂盒及方法， 该组合物包括引物和 探针， 所述引物包括： 上游引物序列： 5 ’‑ CATCTCACAGAGTTACAT CTTTCC‑3’(SEQ ID NO:2)， 下游引物序列： 5 ’ ‑CTTTTTCACCATAGCCCTCTA ‑3’ (SEQ ID NO:3)； 所述探针包括如下序列： 5 ’ ‑ CCTTTCGCTAAGGCTGTTCTTGT ‑3’(SEQ ID NO:4)。 利用本发明提出的组合物可以排除CHO细胞、 大 肠杆菌细胞和人源细胞的基因组DNA的干扰， 能 够有效检测生物制品中残留Vero细胞基因组 DNA， 检测灵敏度高达 0.03fg/μL。 权利要求书1页 说明书15页 附图12页 CN 114807318 A 2022.07.29 CN 114807318 A 1.一种组合物， 其特 征在于， 包括引物和探针， 所述引物包括： 上游引物序列： 5 ’ ‑CATCTCACAGAGT TACATCTTTCC‑3’(SEQ ID NO:2)， 下游引物序列： 5 ’ ‑CTTTTTCACCATAGCCCTCTA‑3’(SEQ ID NO:3)； 所述探针包括如下序列： 5 ’ ‑CCTTTCGCTAAGGCTGTTCTTGT‑3’(SEQ ID NO:4)。 2.根据权利要求1所述的组合物， 其特 征在于， 所述探针序列具有锁核酸 修饰； 任选地， 所述探针序列5 ’端的第3位碱基具有锁核酸 修饰。 3.根据权利要求1 ‑2任一项所述的组合物， 其特征在于， 所述探针进一步携带荧光基 团； 任选地， 所述荧光基团选自下列中的至少之一： FAM、 ROX、 VIC、 CY5、 CY3、 HEX、 5 ‑TAMRA、 TET和JOE 。 4.根据权利要求3所述的组合物， 其特征在于， 所述探针的5 ’端标记荧光基团， 3 ’端标 记淬灭基团， 优选地， 所述探针5 ’端标记FAM荧 光报告基团， 3 ’端标记BHQ1淬灭基团。 5.一种试剂盒， 其特 征在于， 包 含权利要求1 ‑4任一项所述的组合物。 6.根据权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于， 进一步包括下列中的至少一种： PCR缓冲 液、 盐离子、 dNTPs、 DNA聚合酶 或者靶标核酸； 任选地， 进一 步包括PCR增强剂； 任选地， 所述DNA聚合酶为Taq酶； 任选地， 所述盐离 子为Mg2+。 7.根据权利要求5或所述的试剂盒， 其特征在于， 进一步包括下列试剂中的至少一种： DNA提取试剂和核酸纯化试剂。 8.一种检测Vero细胞基因 组DNA的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 将待测样品在PCR扩增体系中进行扩增反应， 所述PCR扩增体系中包括权利要求1 ‑4任 一项所述的组合物或利用权利要求5 ‑7任一项所述的试剂盒配置的， 其中， 所述待测样品包括Vero细胞基因 组DNA； 任选地， 所述待测样品是以Vero细胞的形式提供的； 任选地， 所述待测样品预 先经过Vero细胞基因 组DNA提取处 理； 任选地， 在PCR扩增体系中进行扩增反应， 以便获得靶标核酸的CT值； 以及基于所述靶 标核酸的CT值， 确定待测样品中Vero细胞基因 组DNA的水平； 任选地， 所述靶标核酸包括SEQ  ID NO:1所示的核苷酸序列。 9.根据权利 要求8所述的方法， 其特征在于， 所述的PCR扩增体系包括权利要求1 ‑4任一 项所述的组合物， 其中， 所述组合物中的上游引物、 下游引物和探针的摩尔比为(13 ‑16)： (13‑16)： (12‑15)； 优选地， 所述上游引物、 下游引物和探针的摩尔比为15： 15： 14。 10.根据权利 要求8所述的方法， 其特征在于， 所述PCR扩增反应的条件依次为： 90℃ ‑97 ℃、 0.8‑1.5min， 1个循环； 90℃ ‑97℃、 3‑10s， 55‑65℃、 10‑20s， 38‑42个循环。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114807318 A 2用于检测Vero细胞基因组DNA的组合物、 试剂盒及方 法 技术领域 [0001]本发明涉及生物技术领域， 具体地， 涉及用于检测Vero细胞基因组DNA的组合物、 试剂盒及方法， 更 具体地， 设计一种组合物、 试剂盒、 检测Vero细胞基因 组DNA的方法。 背景技术 [0002]Vero细胞是从非洲绿猴(Cercopithecus  Aethiops)的肾脏上皮细胞中分离培养 出来的细胞系， 它是一种异倍体细胞， 是经过猕猴肾细胞培养衍化后产生的， 和Hela细胞 系、 CHO细胞系和犬肾细胞系(MDCK细胞 )一样， 是在生物制品生产中经常用到的细胞系。 Vero细胞系经常被用到如下领域： 病毒疫苗的制备、 培养病毒的细胞宿 主、 培养真核寄生虫 的细胞宿主、 大肠杆菌毒素的检测等。 [0003]重组生物制品绝大多数由大规模的基 因改造工程宿主细胞生产， 细胞中复杂的非 目标产物是终产物中主要的杂质来源， 直接影响生物制品的安全性。 其中， 残 余的生物遗传 物质DNA是一个非常重要的污染， 因此， 对它的检测是重要的质量控制环 节。 [0004]在重组生物蛋白制品中， 残余D NA多来源于培养的宿主细胞。 这些宿主细胞多为外 源哺乳动物细胞以及肿瘤来源细胞。 理论上， 存在于生物制品中的微量DNA杂质， 都有可能 传递与肿瘤或病毒相关的基因， 并导致癌变或其它病理变化。 当一定量的残留DNA与制品一 同进入人体后， 含有致癌基因的DNA片段就可能诱 发肿瘤的产生； 如果生物制品中含有某些 可以整合病毒的DNA， 则这种DNA通过表达后具 备感染性， 从而导 致一系列的不良后果。 [0005]Vero细胞属于传代细胞系， 易于培养， 适合大规模工业生产， 是世界卫生组织推荐 的人用疫苗细胞基质之一。 因此， 以Vero细胞为基质生产的疫苗的主要风险在于疫苗中残 留的宿主基因组DNA具有潜在的肿瘤致病性。 所以， 建立准确的生物制品中Ver o细胞残留基 因组DNA的定量方法对于疫苗的安全性和质量控制至关重要。 [0006]现阶段， 世界卫生组织推荐的标准是每剂 量制品中的终D NA含量必须小于 10ng； 美 国FDA建议使用检测灵敏度达到10pg的检测方法检测制品中的DNA水平； 中国药典规定每剂 量疫苗中的Ver o细胞基因组DNA的残留量必须小于100pg。 而随着科技的发展和人们对健康 要求越来越高这个大趋势来看， 上述对Vero细胞基因组DNA残留的安全量标准也会变得越 来越高。 因此， 这就需要高效的， 高灵敏度的引物、 探针以及检测试剂来检测生物制品中残 留的Vero基因 组DNA。 [0007]迄今为止， 常用的技术一般是针对V ero细胞基因组中的一类长的串联重复序列设 计引物和探针， 所设计的引物和探针能够具备一定的检测灵敏度， 但仍然不高， 最高的仅能 达到1fg/ μL。 另外， 由于Ver o基因组与人源细胞基因组的同源性很高， 现有技术中设计的引 物并不能很好的排除来自于人源细胞基因组的干扰， 并且 现有技术中设计引物的灵敏度也 并不能满足人们对检测灵敏度要求越来越高的标准。 [0008]综上所述， 本领域急需能够 检测生物制品中残留的V ero细胞基因组D NA的新引物、 探针和检测方法。 所述引物、 探针和检测方法应具备高特异 性， 高灵敏度， 操作简 便， 定量准 确等优点， 从而为 生物制品， 特别是疫苗的质量控制提供有利的支持。说　明　书 1/15 页 3 CN 114807318 A 3