(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210259081.1 (22)申请日 2022.03.16 (71)申请人 浙江省农业科 学院 地址 310021 浙江省杭州市石桥路198号 (72)发明人 吴新义　董君暘　汪宝根　吴晓花　 李国景　鲁忠富　汪颖　王尖　 (74)专利代理 机构 杭州创信知识产权代理有限 公司 33383 专利代理师 杜海东 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 豇豆抗锈病基因紧密连锁的分子标记及其 选育方法 (57)摘要 本发明涉及一种豇豆抗锈病基因紧密连锁 的分子标记， 具体所述分子标记位于11号染色体 上2_05026和2_25169， 其序列如SEQ  No.1和SEQ   No.2所示。 还 提供与抗锈病基因 紧密连锁的KASP 标记引物， 可快速、 简便、 高通量检测豇豆植株是 否具有豇豆锈病抗性， 利用该标记扩增需要鉴定 的材料， 根据其基因型判断这些单株是否携带抗 锈病目的基因。 相比较常规育种方法中对锈病的 抗性鉴定比较繁琐和鉴定技术要求比较高的情 况， 利用本发 明提供的分子标记及其引物进行抗 锈病单株的辅助筛选， 可以在短时间内进行高通 量检测， 与田间鉴定相比， 不受试验用地限制， 可 以在苗期进行淘汰， 大大节省人力物力， 从而加 快豇豆具有抗锈病育种进程， 提高育种效率。 权利要求书2页 说明书6页 序列表2页 附图2页 CN 114941038 A 2022.08.26 CN 114941038 A 1.豇豆抗锈病基因紧密连锁的分子标记， 其特征在于， 所述分子标记位于11号染色体 上2_05026和2_25169， 其序列如SEQ  No.1和SEQ No.2所示。 2.检测权利要求1所述分子标记的引物， 其特 征在于， 所述引物为包括以下 具体序列： a.2_05026KASP引物： 2_05026Primer1： 5 ’ ‑GAAGGTGACCAAGTTCATGCTC CCTTTCTTGCAGTTTTTT‑3’； 2_05026Primer 2： 5’ ‑GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCCTTTCTTGCAGTTTTTC‑3’； 2_05026Primer1和2_0 5026Primer 2为2条特异性引物， 分别连接不同的荧 光序列； 2_05026Primer_Com mon： 5’ ‑AAGTRTACCCCAAAAACGACATGCT TGTTG‑3； b.2_25169KAS P引物： 2_25169Primer1： 5 ’ ‑GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAC CAGCAGAG GAAAGGAGTTGATG‑3’； 2_25169Primer 2： 5’ ‑GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGACCAGCAGAG GAAAGGAGTTGATA‑3’； 2_25169Primer1和2_25169Primer 2为2条特异性引物， 分别连接不同的荧 光序列； 2_25169Primer_Com mon： 5’ ‑ACTCATGCAT TTGCTTGSGTACTC C‑‑3’。 3.权利要求2所述引物、 含有引物的试剂或试剂盒在检测豇豆抗锈病基因中的应用。 4.利用权利要求1所述豇豆抗锈病基因紧密连锁的分子标记进行选育抗锈病 豇豆品种 的方法， 其特 征在于， 所述方法具体包括以下步骤： S1、 提取豇豆植株样本基因组DNA； 以及对照样本豇豆品种G93和豇豆品种特早30的 DNA； S2、 以各豇豆植株样本基因组DNA为模板， 利用2_05026KASP引物和2_25169KASP引物进 行KASP反应检测； 所述2_05026KASP引物为： 2_05026Primer1： 5 ’ ‑GAAGGTGACCAAGTTCATGCTC CCTTTCTTGCAGTTTTTT‑3’； 2_05026Primer 2： 5’ ‑GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCCTTTCTTGCAGTTTTTC‑3’； 2_05026Primer1和2_0 5026Primer 2为2条特异性引物， 分别连接不同的荧 光基团； 2_05026Primer_Com mon： 5’ ‑AAGTRTACCCCAAAAACGACATGCT TGTTG‑3； 所述2_25169KAS P引物为： 2_25169Primer1： 5 ’ ‑GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAC CAGCAGAG GAAAGGAGTTGATG‑3’； 2_25169Primer 2： 5’ ‑GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGACCAGCAGAG GAAAGGAGTTGATA‑3’； 2_25169Primer1和2_25169Primer 2为2条特异性引物， 分别连接不同的荧 光基团； 2_25169Primer_Com mon： 5’ ‑ACTCATGCAT TTGCTTGSGTACTC C‑‑3’； S3、 读取KASP 反应检测的荧光信号， 若豇豆植株样本基因组DNA与G93一致的荧光信号， 则该样本即可判断为携带抗锈病基因， 将表现抗锈病的表型； 若豇豆植株样 本基因组DNA出 现与特早3 0一致的荧光信号， 则该样本不携带抗锈病基因， 将表现感锈病的表型。 5.根据权利要求4所述的选育抗锈病豇豆品种的方法， 其特征在于， 其中Primer1连接 FAM基团， Primer 2连接HEX基团。 6.根据权利要求4所述的选育抗锈病豇豆品种的方法， 其特征在于， KASP反应检测还包 括2X KASP Master mix试剂。 7.根据权利要求6所述的选育抗锈病豇豆品种的方法， 其特征在于， KASP反应检测的权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114941038 A 2PCR体系为： DNA  0.8 μl， 2x KASP Master mix 0.8 μl。 8.根据权利要求4所述的选育抗锈病豇豆品种的方法， 其特征在于， KASP反应检测的 PCR反应程序为94℃预变性15分钟， 94℃变性20秒， 61～55℃复性/延伸60秒， 循环10 次； 再 94℃变性20秒， 5 5℃复性/延伸6 0秒， 循环 26次。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114941038 A 3