(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210252169.0 (22)申请日 2022.03.15 (71)申请人 上海市农业科 学院 地址 201106 上海市闵行区北翟路2 901号 (72)发明人 朱红芳　李晓锋　朱玉英　奚丹丹　 高璐　 (74)专利代理 机构 北京中创博腾知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11636 专利代理师 戴鹏 (51)Int.Cl. C12Q 1/6858(2018.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 不结球白菜红明青菜指纹图谱的建立方法 (57)摘要 本发明公开了不结球白菜红明青菜指纹图 谱的建立方法， 属于分子生物学和植物品种鉴别 技术领域。 本发明提供了30对SSR引物组成的标 记组合， 利用PCR扩增技术和毛细管电泳检测技 术对‘红明青菜 ’品种进行检测， 能够很好的区分 不同的品种， 本发明的品种鉴定检测方法可高效 且精准地对 ‘红明青菜 ’品种进行鉴定， 利用各种 先进仪器进行检测， 操作十分简单， 检测的成本 较低， 本发明提供的检测方法还能有效辨别 ‘红 明青菜’种子的真伪， 可 以有效鉴定出假冒伪劣 的‘红明青菜 ’种子， 保护了 ‘红明青菜 ’种子。 权利要求书4页 说明书5页 附图1页 CN 114574559 A 2022.06.03 CN 114574559 A 1.不结球白菜红明青菜指纹图谱的建立方法， 其特征在于， 包括引物编号 ‑引物名称， 引物编号 ‑引物名称分别为SA000189 ‑cnu_m139a、 SA000190 ‑nia_m086a、 SA000191 ‑nia_ m098a、 SA000192 ‑nia_m138a、 SA000193 ‑cnu_m046a、 SA000194 ‑nia_m121a、 SA000195 ‑cnu_ m073a、 SA000196 ‑cnu_m288a、 SA000197 ‑cnu_m316a、 SA000198 ‑cnu_m327a、 SA000199 ‑nia_ m101a、 SA000200 ‑cnu_m252a、 SA000201 ‑Na10‑D09、 SA000202 ‑cnu_m289a、 SA000203 ‑cnu_ m442a、 SA000204 ‑cnu_m050a、 SA000205 ‑cnu_m149a、 SA000206 ‑nia_m037a、 SA000207 ‑nia_ m049a、 SA000208 ‑cnu_m182a、 SA000209 ‑cnu_m295a、 SA000210 ‑cnu_m090a、 SA000211 ‑cnu_ m537a、 SA000212 ‑cnu_m016a、 SA000213 ‑cnu_m530a、 SA000214 ‑cnu_m534a、 SA000215 ‑nia_ m022a、 SA000216‑nia_m038a、 SA000217‑ENA2、 SA000218‑nia_m035a； 所述分子标记 分别通过以下引物对扩增得到： SEQ  ID NO.1‑2、 SEQ ID NO.3‑4、 SEQ ID  NO.5‑6、 SEQ ID NO.7‑8、 SEQ ID NO.9‑10、 SEQ ID NO.11‑12、 SEQ ID NO.13‑14、 SEQ ID  NO.15‑16、 SEQ ID NO.17‑18、 SEQ ID NO.19‑20、 SEQ ID NO.21‑22、 SEQ ID NO.23‑24、 SEQ  ID NO.25‑26、 SEQ ID NO.27‑28、 SEQ ID NO.29‑30、 SEQ ID NO.31‑32、 SEQ ID NO.33‑34、 SEQ ID NO.35‑36、 SEQ ID NO.37‑38、 SEQ ID NO.39‑40、 SEQ ID NO.41‑42、 SEQ NO.43‑44、 SEQ ID NO.45‑46、 SEQ ID NO.47‑48、 SEQ ID NO.49‑50、 SEQ ID NO.51‑52、 SEQ ID NO.53‑ 54、 SEQ ID NO.55‑56、 SEQ ID NO.57‑58、 SEQ ID NO.59‑60所示的引物对。 2.根据权利要求1所述的不结球白菜红明青菜指纹图谱的建立方法， 其特征在于， 由以 下30对特异性引物对组成， 其为SEQ  ID NO.1‑2、 SEQ ID NO.1‑2、 SEQ ID NO.3‑4、 SEQ ID  NO.5‑6、 SEQ ID NO.7‑8、 SEQ ID NO.9‑10、 SEQ ID NO.11‑12、 SEQ ID NO.13‑14、 SEQ ID  NO.15‑16、 SEQ ID NO.17‑18、 SEQ ID NO.19‑20、 SEQ ID NO.21‑22、 SEQ ID NO.23‑24、 SEQ  ID NO.25‑26、 SEQ ID NO.27‑28、 SEQ ID NO.29‑30、 SEQ ID NO.31‑32、 SEQ ID NO.33‑34、 SEQ ID NO.35‑36、 SEQ ID NO.37‑38、 SEQ ID NO.39‑40、 SEQ ID NO.41‑42、 SEQ ID NO.43‑ 44、 SEQ ID NO.45‑46、 SEQ ID NO.47‑48、 SEQ ID NO.49‑50、 SEQ ID NO.51‑52、 SEQ ID  NO.53‑54、 SEQ ID NO.55‑56、 SEQ ID NO.57‑58、 SEQ ID NO.59‑60。 3.根据权利要求2所述的不结球白菜红明青菜指纹图谱的建立方法， 其特征在于， 还包 括试剂盒。 4.根据权利要求2所述的不结球白菜红明青菜指纹图谱的建立方法， 其特征在于， 所述 分子标记或引物组合应用于鉴定 ‘红明青菜 ’的品种。 5.根据权利要求2所述的不结球白菜红明青菜指纹图谱的建立方法， 其特征在于， 所述 分子标记或引物组合应用于鉴定 ‘红明青菜 ’及‘苏州青’种质资源品种。 6.根据权利要求1所述的不结球白菜红明青菜指纹图谱的建立方法， 其特征在于， 所述 的引物组合对 ‘红明青菜 ’和‘苏州青’品种的DNA进行PCR扩增和一代测序和利用毛细管电 泳检测PCR产物； 扩增产物读带为无时， 显性标记时记录为0； 扩增条件为有时， 显性标记记录为1； 条带 较弱或无法判断基因型时记录为？ ， 无效条带记录为 ‑‑； 共显性标记中纯合位点的等位变异 大小数据记录为X/X， 扩增产物读带为纯合亲本1， 其中X为该位点等位变异的大小； 纯合位 点的等位变异大小数据记录为Y/Y， 扩增产物读带为纯合亲本2， Y为该位点等位变异的大 小； 杂合位点的等位变异数据 记录为X/Y， 扩增产 物为双亲带型， 其中X、 Y为该位点上两个不 同的等位变异； 条带较弱或无法判断基因型时记录为？ ， 无效等位变异的大小记录为 ‑‑； 上权　利　要　求　书 1/4 页 2 CN 114574559 A 2述“/”前为小片段， “/”后为大片段； 通过对不同位点的数据整合， 形成 ‘红明青菜 ’及其亲本 和‘苏州青’品种的SSR指纹图谱。 7.根据权利要求6所述的不结球白菜红明青菜指纹图谱的建立方法， 其特征在于， 其特 征在于， PCR扩增方法为： 反应程序 为： 将PCR试剂加入到1.5ml离心管中， 混合后用110 μL的石蜡油覆盖在混合液 上， 打开PCR反应仪， 设定好如下数据： 94℃预变性5min； 94℃变性50s， 45℃退火50s， 78℃延 伸70s， 将1.5ml离心管放入仪器中进行扩增， 将共循环3 0次， 78℃延伸10mi n； 反应体系： 25μL反应体系体积， 含每种dNTP2.5mmol/L， 正向引物和反向引物各2.5μ mol/L， Taq DNA聚合酶2.0U， 5倍PCR缓冲液， MgCl2  2.5mmol/L， 样品DNA3 0‑50ng。 8.根据权利要求7所述的不结球白菜红明青菜指纹图谱的建立方法， 其特征在于， 鉴别 ‘红明青菜 ’品系和‘苏州青’中的应用， 或在 ‘苏州青’种质资源改良中的应用。 9.根据权利要求1所述的不结球白菜红明青菜指纹图谱的建立方法， 其特征在于， 所述 ‘红明青菜 ’指纹图谱为 ‘红明青菜 ’和‘苏州青’指纹图谱， 分别如下： 和 和权　利　要　求　书 2/4 页 3 CN 114574559 A 3