(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210252375.1 (22)申请日 2022.03.15 (71)申请人 华智生物技 术有限公司 地址 410000 湖南省长 沙市芙蓉区合平路 618号 (72)发明人 雷雨婷　唐顺学　田冰川　谢心悦　 (74)专利代理 机构 广州嘉权专利商标事务所有 限公司 4 4205 专利代理师 马俊 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) (54)发明名称 鉴定耐咪唑啉酮类除草剂油菜的KASP标记 引物、 试剂盒及其应用 (57)摘要 本发明公开了鉴定耐咪唑啉酮类除草剂油 菜的KASP标记引物、 试剂盒及其应用， 涉及作物 分子遗传育种技术领域。 本发明的KASP标记引物 组包括用于检测AHSH1基因的KASP标记引物组 BN‑PM1.1和BN ‑PM1.2， 用于检测AHSH3基因的 KASP标记引物组BN ‑PM2.1和BN ‑PM2.2。 该组KASP 标记引物组特异性高、 质量好、 灵敏度及分辨力 高， 能精准、 快速、 高效、 特异地鉴定油菜A HAS1基 因及AHAS3 基因中PM1和PM2的变异位 点。 权利要求书2页 说明书12页 序列表6页 附图11页 CN 114540347 A 2022.05.27 CN 114540347 A 1.一组KASP标记引 物组， 其特征在于， 包括用于检测AHSH1基因的KASP标记引物组BN ‑ PM1.1和BN ‑PM1.2， 用于检测AHSH 3基因的KAS P标记引物组BN ‑PM2.1和BN ‑PM2.2； 所述BN‑PM1.1的两条特异性引物Primer  X1和Primer  Y1的核苷酸序列分别如SEQ  ID  NO.3和SEQ  ID NO.4所示； 所述BN‑PM1.2的两条特异性引物Primer  X2和Primer  Y2的核苷酸序列分别如SEQ  ID  NO.6和SEQ  ID NO.7所示； 所述BN‑PM2.1的两条特异性引物Primer  X7和Primer  Y7的核苷酸序列分别如SEQ  ID  NO.18和SEQ  ID NO.19所示； 所述BN‑PM2.2的两条特异性引物Primer  X8和Primer  Y8的核苷酸序列分别如SEQ  ID  NO.21和SEQ  ID NO.22所示。 2.根据权利 要求1所述的KASP标记引物组， 其特征在于， 所述KASP标记引物 组还包括通 用引物； 所述BN‑PM1.1的通用引物Primer  C1的核苷酸序列如SEQ  ID NO.5所示； 所述BN‑PM1.2的通用引物Primer  C2的核苷酸序列如SEQ  ID NO.8所示； 所述BN‑PM2.1的通用引物Primer  C7的核苷酸序列如SEQ  ID NO.20所示； 所述BN‑PM2.2的通用引物Primer  C8的核苷酸序列如SEQ  ID NO.23所示。 3.根据权利要求1所述的KASP标记引物组， 其特征在于， 所述Primer  X1和所述Primer   Y1分别连接不同的荧 光接头序列； 所述Primer  X2和所述Primer  Y2分别连接不同的荧 光接头序列； 所述Primer  X7和所述Primer  Y7分别连接不同的荧 光接头序列； 所述Primer  X8和所述Primer  Y8分别连接不同的荧 光接头序列。 4.根据权利要求3所述的KASP标记引物组， 其特征在于， 所述荧光接头序列为FAM荧光 接头序列或H EX荧光接头序列。 5.一种试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括权利要求1 ‑4任一项所述的KASP标记引物 组。 6.一种基因芯片， 其特征在于， 所述基因芯片包括权利要求1 ‑4任一项所述的KASP标记 引物组。 7.权利要求1 ‑4任一项所述的KASP标记引物 组在鉴定或辅助鉴定耐除草剂油菜中的应 用。 8.权利要求1 ‑4任一项所述的KAS P标记引物组在油菜种质资源改良中的应用。 9.一种耐除草剂油菜的鉴定方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)以待测油菜样品基因组DNA为模板， 利用权利要求1 ‑4任一项所述的KASP标记引 物 组进行PCR扩增， 获得扩增产物； (2)对所述扩增产物进行检测与分析， 判断所述油菜样品是否为耐除草剂油菜； 所述步骤(1)中， 所述KASP标记引物组包括所述BN ‑PM1.1和所述BN ‑PM1.2中的至少一 种， 以及所述BN ‑PM2.1和所述BN ‑PM2.2中的至少一种。 10.根据权利要求9所述的方法， 其特 征在于， 所述 步骤(2)中， 所述分析的方法为： 1)针对所述B N‑PM1.1或所述B N‑PM1.2的检测结果， 若仅检测到所述Primer  X对应的荧 光信号， 则判断所述待测油菜样品AHSH1基因第653位密码 子非保守碱基仅为G； 若仅检测到权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114540347 A 2所述Primer  Y对应的荧光信号， 则判断所述待测油菜样品AHSH1基因第653位密码 子非保守 碱基仅为A； 若同时检测到Primer  X和Primer  Y对应的荧光信号， 则判断所述待测油菜样品 AHSH1基因第6 53位密码子非保守 碱基为G和A； 2)针对所述B N‑PM2.1或所述B N‑PM2.2的检测结果， 若仅检测到所述Primer  X对应的荧 光信号， 则判断所述待测油菜样品AHSH3基因第574位密码 子非保守碱基仅为G； 若仅检测到 所述Primer  Y对应的荧光信号， 则判断所述待测油菜样品AHSH3基因第574位密码 子非保守 碱基仅为T； 若同时检测到Primer  X和Primer  Y对应的荧光信号， 则判断待测油菜 所述样品 AHSH3基因第574 位密码子非保守 碱基为G和T； 3)结合1)和2)， 若所述待测油菜样品AHSH1基因第653位密码子非保守碱基仅为A且 AHSH3基因第574位密码 子非保守碱基仅为T， 或AHSH1基因第653位密码 子非保守碱基为A和 G且AHSH3基因第574位密码子非保守碱基为T和G， 则判断所述待测油菜样品为耐除草剂油 菜。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114540347 A 3