(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210249414.2 (22)申请日 2022.03.14 (83)生物保 藏信息 CCTCC NO： V202204 2022.01.25 (71)申请人 中国科学院武汉病毒研究所 地址 430000 湖北省武汉市武昌区水果湖 街小洪山中区4 4号 (72)发明人 夏菡　袁志明　任南洁　王飞　 张桂林　 (74)专利代理 机构 北京金智普华知识产权代理 有限公司 1 1401 专利代理师 张晓博 (51)Int.Cl. C12N 15/40(2006.01) C12N 15/12(2006.01)C12N 15/11(2006.01) C12N 15/85(2006.01) C12N 15/65(2006.01) C12N 7/01(2006.01) C12Q 1/70(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 艾比湖病毒的核酸组合物及其应用 (57)摘要 本申请公开了一种用于表达重组艾比湖病 毒相关基因与蛋白的核酸组合物及其应用。 该核 酸组合物包括具有如SEQ  ID NO.14、 15、 16和17 所示的序列的核酸分子。 本申请还以此核酸组合 物构建了重组艾比湖 病毒， 该病毒不仅对哺乳动 物和蚊细胞具有广谱感染性， 可稳定传代， 还带 有绿色荧光， 能够为体内外病毒 示踪、 病毒检测、 抗病毒药物及疫苗筛选等领域中提供研究基础， 具有十分重大的应用前 景。 权利要求书1页 说明书7页 序列表18页 附图3页 CN 114836442 A 2022.08.02 CN 114836442 A 1.用于表达 重组艾比湖病毒相关蛋白的核酸组合物， 其中， 所述核酸组合物包括： 艾比湖病毒L节段， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.14所示； 艾比湖病毒M节段， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.15所示； 艾比湖病毒S节段， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.16所示； 以及 绿色荧光蛋白的基因片段， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.17所示。 2.质粒组合物， 其中包括分别以SEQ  ID NO.14、 15、 16和17所示的核苷酸序列构建的重 组质粒， 用于构建重组艾比湖病毒。 3.根据权利要求2所述的质粒组合物， 其中包括pLCK ‑EBIV‑L、 pLCK‑EBIV‑M和pLCK‑ EBIV‑eGFP/S， 其核苷酸序列依次如SEQ  ID NO.18、 19和20所示。 4.用于扩增如权利要求1所述的核酸组合物的引物组， 其中包括： 用于扩增如SEQ  ID NO.14所示的核酸序列的引物对， 如SEQ  ID NO.1～2所示； 用于扩增如SEQ  ID NO.15所示的核酸序列的引物对， 如SEQ  ID NO.3～4所示； 以及 用于扩增如SEQ  ID NO.16所示的核酸序列的引物对， 如SEQ  ID NO.5～6所示。 5.用于扩增如权利要求1所述的核酸组合物的试剂 盒， 其中包括如权利要求4所述的引 物组。 6.一种重组艾比湖病毒毒株， 所述毒株携带如SEQ  ID NO.14、 15、 16和17所示基因序 列， 并于2022年1月25日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏地址为中国.武汉.武汉大 学， 保藏编号 为CCTCC NO.V202204。 7.一种重组宿主菌， 携带如SEQ  ID NO.14、 15、 16和17 所示的核酸序列。 8.一种制备重组艾比湖病毒 毒株的方法， 所述方法包括以下步骤： 用权利要求5所述的引物组扩增出如权利要求1所述的基因序列； 将所述基因序列 与质粒连接， 以得到如权利要求2 ～4任一项所述的重组质粒； 获得携带 所述重组质粒的如权利要求7 所述的重组宿主菌的阳性克隆培 养物； 从所述阳性克隆培 养物中获得 大量的所述重组质粒； 将所述重组质粒转染至宿主细胞， 并进行培 养； 收获转染后的培 养物， 所述培 养物中含有所述重组艾比湖病毒 毒株。 9.根据权利要求8所述 的方法， 其中， 所述重组质粒包括pLCK ‑EBIV‑L、 pLCK‑EBIV‑M和 pLCK‑EBIV‑eGFP/S质粒， 以共转染的方法进行转染。 10.如权利要求1所述的核酸组合物的应用， 所述应用包括制备重组艾比湖病毒、 表达 与所述重组艾比湖病毒相关的蛋白、 筛选拮抗艾比湖病毒的药物、 于体内外示踪重组艾比 湖病毒、 制备抗艾比湖病毒 疫苗和制备 艾比湖病毒检测相关产品中的至少一项。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114836442 A 2艾比湖病毒 的核酸组合物及其应用 技术领域 [0001]本申请涉及艾比湖病毒技 术领域， 尤其涉及艾比湖病毒的核酸组合物及其应用。 背景技术 [0002]艾比湖病毒(Ebinur  Lake virus， EBIV)， 属泛布尼亚病毒科正布尼亚病毒属， 是 布尼亚韦拉(Bunyamwera)血清群的新成员， 2014年在我国新 疆艾比湖地区的凶小库蚊中首 次分离得到。 该病毒的粒子呈球形， 有囊膜， 基因组由三个相互独立的单链RNA片段构成， 分 别为L、 M和S片段。 前期研究发现， 小鼠对EBIV高度易 感， 甚至极低的感染剂量(1PFU)也对小 鼠致死。 感毒小鼠的周围组织和中枢神经系统中均检测到病毒， 且在肝脏、 脾脏、 胸腺和脑 中均观察到明显的组织病理学变化。 血液成分分析显示感染小鼠的白细胞、 血小板减少， 谷 丙转氨酶、 乳酸脱氢酶和 肌酸激酶明显升高。 此外， EBIV感染在小鼠的血清， 脾脏和大脑中 可引起明显的细胞 因子变化。 值得注 意的是， 艾比湖周边人群血清流行病学调查结果表明， 人群中存在  EBIV的IgM、 IgG以及中和抗体， 暗示该病毒对人类具备潜在的致病和感染风 险。 利用反向遗传学系统可获得人工重组的病毒， 进一步还可用于研究病毒的复制、 入侵、 基因功能、 药物筛选和疫苗开 发等。 然而， 目前还 未见利用反向遗传学系统构建重组艾比湖 病毒的相关研究报导， 其阻碍 了对新发蚊媒艾比湖病毒的深入研究。 发明内容 [0003]有鉴于此， 本申请的目的在于开发一种重组艾比湖病毒及其构建方法， 以弥补现 有技术中的对该病毒相关基因序列 功能研究的空白， 并为更加深入探讨该病毒致病性和传 播机制等 提供基础帮助。 [0004]第一方面， 本申请实施例公开了用于表达重组艾比湖病毒相关蛋白的核酸序列组 合， 其中包括： 艾比湖病毒L节段， 其核苷 酸序列如SEQ  ID NO.14所示； 艾比湖病毒M节段， 其 核苷酸序列如SEQ  ID NO.15所示； 艾比湖病毒S节段， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.16所示； 以及绿色荧 光蛋白的基因片段， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.17所示。 [0005]第二方面， 本申请实施例公开了质粒组合物， 其中包括分别以SEQ  ID NO.14、 15、 16和17 所示的核苷酸序列构建的重组质粒， 用于构建野生型或重组艾比湖病毒。 其中， 术 语“野生型艾比湖病毒 ”即在自然环境中筛选和分离得到的艾比湖病毒， 术语 “重组艾比湖 病毒”即利用反向遗传学手段对所述的野生型艾比湖病毒拯救， 或对野生型艾比湖病毒进 行基因改造、 基因标记、 基因重组等得到的既能表达艾比湖病毒常规的遗传特性、 还能过表 达/缺失某些基因、 亦或者能够表达某些 标签基因的艾比湖病毒 毒株。 [0006]第三方面， 本申请实施例公开了用于第一方面所述的核酸组合物的引 物组， 其中 包括： 用于扩增如SEQ  ID NO.14所示的核酸序列的引物对， 如SEQ  ID NO.1～2所示； 用于扩 增如SEQ ID  NO.15所示的核酸序列的引物对， 如SEQ  ID NO.3～4所示； 以及用于扩增如SEQ   ID NO.16 所示的核酸序列的引物对， 如SEQ  ID NO.5～6所示。 [0007]第四方面， 本申请实施例公开了用于扩增第一方面所述核酸组合物的试剂盒， 其说　明　书 1/7 页 3 CN 114836442 A 3