(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210246590.0 (22)申请日 2022.03.14 (71)申请人 海南医学院 地址 571199 海南省海口市学院路 (72)发明人 尹飞飞　薛莉颖　田秀颖　黄艺　 肖美芳　王高玉　彭箬岩　杜江　 杜永国　张丽媛　胡小媛　谢晓菲　 贾毅博　邓宛心　黎悠悠　李子涵　 (74)专利代理 机构 北京国谦专利代理事务所 (普通合伙) 11752 专利代理师 肖应国 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6837(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12R 1/01(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种同时检测三类病原体的液相芯片及方 法 (57)摘要 本发明提供了一种用于同时检测三类病原 体的引物和探针组合物和检测方法， 这三类病原 体包括恙 虫病东方体、 Q热立克次体、 普氏立克次 体、 发热伴血小板减少综合征病毒和汉坦病毒， 引物和探针组合物包括对应的5套引物和探针组 合物， 其核苷酸序列依次为序列表中SEQIDN O:1‑ 21所示， 本发明提供的检测方法经过杂交条件优 化， 在同一个反应管中可以完成5种病原 体的PCR 扩增和杂交反应， 反应后根据液相芯片悬浮仪自 动输出数据， 最低能检测到102copy/μL病毒 DNA， 整个检测过程简便、 快速、 成本低， 特异性和 敏感性高、 适用于大量样品的高通量快速检测， 具有了良好的应用前 景。 权利要求书2页 说明书8页 序列表4页 CN 114540551 A 2022.05.27 CN 114540551 A 1.一种引物和探针组合物， 用于同时检测三类病原体， 所述三类病原体包括立克次体、 发热伴血小板减少综合征病毒和汉坦病毒， 其中， 所述立克次体包括恙虫病东方体、 Q热立 克次体、 普氏立克次体； 所述引物和探针组合物包括： 根据恙虫病东方体的47 ‑kDahtrA基因序列设计的引物47 ‑kDa‑F1、 47‑kDa‑R1和47‑ kDa‑R2,探针47 ‑kDa‑probe； 根据Q热立克次体的IS1 111基因序列设计的引物Q ‑F1、 Q‑F2、 和Q‑R1,探针Q‑probe； 根据普氏立克次体的htrA基因序列设计的引物Rick ‑F1、 Rick ‑F2、 和Rick ‑R1,探针 Rick‑probe； 根据发热伴血小板减少综合征病毒的L片段序列设计的引物SFTSV ‑F1、 SFTSV ‑R1、 SFTSV‑F2和SFTSV ‑R2,探针SFTSV ‑probe； 根据汉坦病毒的S片段序列设计的引物Hanta ‑F1、 Hanta ‑R1和Hanta ‑R2,探针Hanta ‑ probe； 所述引物和探针组合物的核苷酸序列依次为序列表中SEQ  ID NO:1‑21所示。 2.根据权利要求1所述的引物和探针组合物， 其特征在于： 所述引物和探针组合物用于 液相芯片， 与对应SEQ  ID NO:1‑21所示的序列相比,分别具有不超过5个核苷酸的置换、 缺 失或添加， 或者分别具有80％ ‑99.99％的序列同一性， 且与SEQ  ID No:1‑21的序列具有相 同功能。 3.根据权利要求1所述的引物和探针组合物， 其特征在于： 所述引物为多重不对称PCR 扩增引物。 4.一种同时检测三类病原体的液相芯片检测方法， 其特征在于： 所述方法包含参与反 应的权利要求1 ‑3任一项中所述的引物和探针组合物； 所述方法包括： 制备检测微球： 取磁珠振荡超声后， 和所述探针充分振荡偶联 形成检测微球； 制备PCR反应体系： 制备25 μL反应体系， 包括DNA  1.0 μL、 PCR预混液12.5 μL、 上下游引物 (10 μM)各0.5 μL、 去离 子水； PCR扩增反应： 98℃预变性5min， 98℃ 30s， 58℃30s， 72℃1min， 40个循环， 最后72℃延伸 5min； 制备杂交反应 体系： 检测微球各0.5 μL、 3 3 μL 1.5xTMAC、 12 μL  TE、 PCR产物5 μL； 杂交反应： 95℃变性5mi n， 55℃‑58℃杂交10 ‑15min； 微球标记： 在上述杂交液中， 加入10μL  50μg/mL链霉素亲和 素、 R‑藻红蛋白偶联物， 55 ℃反应10mi n； 结果检测： 将上述反应液转移至96孔版， 使用液相芯片悬浮仪进行检测。 5.根据权利要求4所述的同时检测三类病原体的液相芯片检测方法， 其特征在于： 所述 磁珠选用Ma gPLEX磁珠。 6.根据权利要求4所述的同时检测三类病原体的液相芯片检测方法， 其特征在于： 杂交 反应中， 杂交温度为58℃， 杂交时间为15mi n。 7.根据权利要求4所述的同时检测三类病原体的液相芯片检测方法， 其特征在于： 所述 结果检测中， 液相芯片悬浮仪能够检测磁珠的荧光强度值为Median值， 输出的数据为每一 种微球的平均荧 光强度值， 即MFI 值。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114540551 A 28.根据权利要求4所述的同时检测三类病原体的液相芯片检测方法， 其特征在于： 所述 液相芯片检测方法还包括阴性对照， 检测待测样品的MFI值为检测阴性对照的MFI值的三倍 以上时， 判断结果 为阳性。 9.一种同时检测三类病原体的液相芯片的试剂 盒， 其特征在于： 至少包含权利要求1 ‑3 任一项中所述的引物和探针组合物、 磁珠， 和同时检测三类病原体的液相芯片的杂交反应 体系。 10.根据权利要求9所述的同时检测三类病原体的液相芯片的试剂盒， 其特征在于： 所 述试剂盒包括标准物质和阴性对照。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114540551 A 3