(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210244862.3 (22)申请日 2022.03.14 (71)申请人 连云港市第二人民医院(连云港市 临床肿瘤研究所） 地址 222000 江苏省连云港市海州区幸福 路161号 (72)发明人 高绪柱　王蕾　王方　黄关宏　 (74)专利代理 机构 无锡苏元专利代理事务所 (普通合伙) 32471 专利代理师 邓琪 (51)Int.Cl. C12Q 1/6844(2018.01) C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于耐碳青霉烯的鲍曼不动杆菌RPA-LFS检 测法的引物探 针组合及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种用于耐碳青霉烯的鲍曼 不动杆菌RPA ‑LFS检测法的引物探针组合 blaOXA‑23‑F3/P/RB， 本发明的RPA ‑LFS引物探针 组合用于检测时简单、 快速、 准确， 不需要实验室 设施， 并可与简单快速的DNA提取方法(热煮)相 结合， 用于CRAB的家庭检测， 可及时的诊断可以 促进鼻腔内鲍曼不动杆菌感 染的早期治 疗。 权利要求书1页 说明书7页 序列表3页 附图2页 CN 114703257 A 2022.07.05 CN 114703257 A 1.用于耐碳青霉烯的鲍曼不动杆菌RPA ‑LFS检测法的引物探针组合， 其特征在于， 引物 探针组合 为blaOXA ‑23‑F3/P/RB， 其序列如下： blaOXA‑23‑F3： TGGTTCTCCAATCCGATCAGGGCATTCAACATT； blaOXA‑23‑P： FITC‑CTTGTACAATCTGACTCGAG GTTTCATTTA[THF]TACACTATGCTGTGC ‑C3Spacer； blaOXA‑23‑RB： Biotin‑TTTACTTGCTATGTG GTTGCTTCTCTTTTTCTTTC。 2.权利要求1所述的引物探针组合在耐碳青霉烯的鲍曼不动杆菌RPA ‑LFS检测中或检 测试剂盒的制备中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114703257 A 2用于耐碳 青霉烯的鲍曼不 动杆菌RPA‑LFS检测法的引物探针 组合及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及鲍曼不动杆菌检测领域， 具体为用于耐碳青霉烯的鲍曼不动杆菌RPA ‑ LFS检测法的引物探针组合及其应用。 背景技术 [0002]鲍曼不动杆菌是一种常见的院内感染病原体。 鲍曼不动杆菌被世界卫生组织归类 为最危险的细菌之一。 此外， 鲍曼不动杆菌对多种抗生素具有抗药性， 因此， 引起了微生物 学家和医生的广泛关注。 耐碳青霉烯的鲍曼不动杆菌(CRAB)继续在全球迅速蔓延。 根据碳 青酶(OXA)的产生情况， 鲍曼不动杆菌被分为五个相关的亚群。 OXA ‑51是内在的， 而OXA ‑ 143、 OXA‑58、 OXA‑40和OXA‑23是后天的。 CARB对各种抗菌剂具有抗性， 主要是由于产生了 OXA和金属β ‑内酰胺酶。 最常见的CARB 分离物产生OXA ‑23碳青霉烯酶。 blaOXA ‑51基因是检 测鲍曼不动杆菌的既定标记， 而blaOXA ‑23基因是检测CRAB的既定标记。 [0003]快速检测CRAB可以促进早期治疗， 并将感染的严重程度降到最低。 已经报道了几 种检测鲍曼不动杆菌的诊断方法， 包括环路介导的等温扩增法(LAMP)、 聚合酶链反应 (PCR)、 定量PCR(qPCR)和基于培养的方法。 尽管这些方法有独特的优势， 但都受到时间要 求、 低灵敏度、 需要 热循环设备和对训练有 素人员的依赖等限制。 这些缺点可能抑制了这些 方法在床边的日常监测中的应用。 为了应对CRAB的广泛传播， 建立一种简单、 快速、 准确和 廉价的现场诊断方法非常重要。 重组酶聚合酶扩增(RPA)是一种等温的DNA扩增技术， 于 2006年首次报道， 近年 来被广泛使用。 [0004]RPA系统依靠重组酶(UvsX和UvsY)、 单链结合蛋白(gp32)和链式置换DNA聚合酶 (Bsu)进行核酸扩增。 RPA反应不需要严格的孵化 温度， 因为指数扩增是在25 ‑42℃的恒温下 进行的， 通常在37℃， 反应在大约30分钟内完成。 RPA的扩增产 物可以用凝胶电泳、 荧光检测 器和侧流条(LFS)进行检测。 然而， 在实验室外， 凝胶电泳和荧光检测的灵敏度是有限的。 相 反， LFS适用于简单的检测， 检测结果可以直观地分析， 而不需要复杂的热循环设备和经过 培训的人员。 可视化取决于探针的5'和3'端分别有一个异硫氰酸荧光素(FITC)标签和一个 C3阻滞位点。 在探针的中间， 一个碱基也被四氢 呋喃(THF)取代。 探针与扩增链的结合是通 过内切酶IV(Nfo)的裂解开始的， 它释放出探针的3'端进行延伸。 使用生物素标记的反向引 物， 扩增产物的5'和3'端分别用FITC和生物素标记。 LFS的共轭垫上的金纳米粒子标记 (AuNP标记)的抗FITC抗体可 以与扩增产物结合， 随后被涂有链霉蛋白的检测线捕获并聚 集， 如红色阳性信号所示。 RPA ‑LFS检测在作为各种传染病的诊断性试验时， 可以达到快速 反应时间和良好的准确性。 发明内容 [0005]本发明针对目前的耐碳青霉烯的鲍曼不动杆菌(CRAB)检测方法， 包括PCR、 qPCR和 LAMP等方法， 需要使用特定的设备， 而这些设备在小型医院中并不容易获得。 此外， 用这些说　明　书 1/7 页 3 CN 114703257 A 3