(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210235429.3 (22)申请日 2022.03.11 (71)申请人 丽水市质量检验检测研究院 地址 323000 浙江省丽水市莲都区中山 街 北395号 (72)发明人 章小洪　陈卫平　卢光英　陈梦　 姜川　刘杨春　汪昕　贺云鹏　 (74)专利代理 机构 杭州君度专利代理事务所 (特殊普通 合伙) 33240 专利代理师 郑芳 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/42(2006.01) (54)发明名称 基于ttr基因的沙门氏菌检测试剂盒及非诊 断性检测方法 (57)摘要 本发明涉及一种基于ttr基因的沙门氏菌检 测试剂盒及非诊断性检测方法， 试剂盒含有以下 特异性引物： 上游 外引物F3如SEQ  ID NO.1所示， 下游外引物B3如SEQ  ID NO.2所示， 上游内引物 FIP如SEQ  ID NO.3所示， 下游内引物BIP如SEQ   ID NO.4所示， 上游环引物LF如SEQ  ID NO.5所 示， 下游环引物LB如SEQ  ID NO.6所示。 本发明设 计一条特有的LA MP引物对沙门氏菌进行检测， 同 时结合短时间增菌和MPN计数建立了mini ‑MPN‑ LAMP沙门氏菌 快速定量检测方法； 本发明灵敏度 高， 特异性好， 操作简单快速， 准确可靠， 检测成 本低。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图1页 CN 114717341 A 2022.07.08 CN 114717341 A 1.一种基于t tr基因的沙门氏菌检测试剂盒， 其特 征在于含有以下 特异性引物： 上游外引物F3如SEQ  ID NO.1所示， 下游外引物B3如SEQ  ID NO.2所示， 上游内引物FIP 如SEQ ID NO.3所示， 下游内引物BIP如SEQ  ID NO.4所示， 上游环引物LF如SEQ  ID NO.5所 示， 下游环引物LB 如SEQ ID NO.6所示。 2.根据权利要求1所述基于ttr基因的沙门氏菌检测试剂盒， 其特征在于： 所述试剂盒 包括多孔板、 无菌离心管、 BPW培养液、 无菌生理盐水、 对照标准菌株DNA、 LAMP反应体系试 剂。 3.一种权利要求1所述基于ttr基因 的沙门氏菌检测试剂 盒的非诊断性检测方法， 其特 征在于包括下述 步骤： (1)制作检测沙门氏菌的环介导 等温扩增试剂盒； (2)样品制备和DNA提取； (3)进行沙门氏菌的环介导等温扩增反应： 按照LAMP反应体系对每个提取样品进行检 测， 依次确证沙门氏菌阳性管 数； (4)沙门氏菌MPN的报告： 按照确证的沙门氏菌阳性管数， 检索MPN表， 报告每g或每mL样 品中沙门氏菌的MPN 值。 4.根据权利要求3所述基于ttr基因 的沙门氏菌检测试剂 盒的非诊断性检测方法， 其特 征在于LAMP反应体系为： 10X  ThermoPol  Buffer 2 μL， MgSO4 1.2 μL， dNTP  Mixture 2.8 μL， 50X LAMP荧光染料0.2μL， ROX参比荧光染料0.2μL， 10X  Primers Mix 2μL， Bst 2.0  WarmStar t DNA聚合酶0.8 μL， DNA粗 提液5 μL， 加无RNA酶水至20 μL。 5.根据权利要求3所述基于ttr基因 的沙门氏菌检测试剂 盒的非诊断性检测方法， 其特 征在于LAMP反应条件为： 65℃保温反应40min， 以1min作1个循环检测荧光值， 结束后按65～ 95℃， 0.2℃/s测定溶解曲线。 6.根据权利要求3所述基于ttr基因 的沙门氏菌检测试剂 盒的非诊断性检测方法， 其特 征在于步骤(2)具体为： (a)样品的前处 理： 无菌操作称取样品， 置于盛有BPW的无菌均质杯或合适容器内， 均质； 若样品为液态， 不 需要均质， 振荡混匀； 使用BPW增 菌液对样 品均液进行10倍梯度稀释， 取3个浓度， 每个浓度 分别取1mL至 3个离心管， 置 于36℃增菌5h后分别进行DNA提取； (b)待测样品模板DNA的制备： (b‑1)对照标准菌株菌液制备： 沙门氏菌标准菌株的DNA作阳性对照， 大肠埃希氏菌DNA 作为阴性对照， 标准菌株接种于血平板中36℃培养24h进行活化， 再接种于BPW培养基中36 ℃培养16h得到新鲜菌液； (b‑2)样品与对照菌株的模板DNA制备： 采用快速煮沸法提取核酸， 吸取1mL样液于 12000r/min离心 5min， 移去上清液9 00 μL， 加入1mL无菌 水后混匀再 12000r/min离心 5min， 移 去上清液900 μL， 置于100℃电热板中加热15min， 迅速冷却后12000r/min离心1min， 移取上 清液直接用于LAMP实验； 上清即作为模板DNA。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114717341 A 2基于ttr基因的沙门氏菌检测试剂盒及非诊断性检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于食品微生物技术领域， 涉及一种食品微生物检测试剂盒及其检测方 法， 具体地说是 涉及一种基于t tr基因的沙门氏菌检测试剂盒及非诊断性检测方法。 背景技术 [0002]基因的选择对于沙门氏菌的鉴定至关重要。 invA基因是沙门氏菌属检测最常用的 目标基因。 该基因编 码位于沙门氏菌致病岛(SPI)上的入侵蛋白， 在沙门氏菌致病过程中起 着重要的作用， 是侵袭宿主细胞所需的毒力因子， 大多数已发表的文献和商品化的试剂盒 都以invA基因作为靶基因进行检测。 [0003]近年来， TURKI等 发现分离出的12.3％的S.enterica  serovar Kentucky分离株无 法检测出invA基因， 另外， S.enterica  serovar Litchfield和 Senftenberg等菌株在自然 界中也可能会缺 失invA， 通过生物信息学分析和综合测试评价 发现invA在沙门氏菌中的特 异性能只能达 到97.6％～ 97.8％。 [0004]根据沙门菌属特有的靶序列肠毒素基因序列， 设计2对特殊的内、 外引物(内引物 FIP与BIP， 外引物F3与B3)， 特异性识别靶序列上的六个独立区域， 为增加反应速度， 还设计 1对环引物(LF与LB)。 利用Bst  DNA聚合酶启动循环链置换反应， 在肠毒素基因序列启动互 补链合成， 在同一链上 互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎环DNA混合物； 从 dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合， 产生副产物(焦磷酸镁)形成白色沉淀， 同时反应液pH会降低， 最终可通过颜色变化观察判定结果。 [0005]MPN计数法是一种基于概率计算的计数方法， 使用上比平板计数法更具灵活性， 对 培养基的选择性要求低， 检出限可根据加样量进 行调整， 因此MPN计数法广泛用于食品中大 肠菌群、 金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌等微生物的定量检测。 虽然国家标准GB  4789.4‑ 2016 《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》 中未制定沙门氏菌的定量检测 方法， 但在美国分析化学家协会(AOAC)、 美国环保局(EPA)等机构制定的国际标准中均有沙 门氏菌MPN计数法的使用， 可见MPN计数法在定量检测沙门氏菌的重要地位； 但是， 试管法的 MPN计数法操作繁杂， DNA提取需要 进行浓缩， 时间较长 。 发明内容 [0006]为了克服现有技术存在的不足， 本发明提供了一种基于ttr基因的沙门氏菌检测 试剂盒及非诊断性检测方法。 [0007]本发明所采用的技 术方案为： [0008]一种基于t tr基因的沙门氏菌检测试剂盒， 含有以下 特异性引物： [0009]上游外引物F3： 5 ’ ‑TCAGTGGCTAAAAGTCGGTC‑3’； [0010]下游外引物B3： 5 ’ ‑CGCACTGTGTC CAACAGC‑3’； [0011]上游内引物FIP： [0012]5’ ‑GTTACCTTGCCGGACGTCCCACTTTTGGTCTGAGCTAC C‑3’；说　明　书 1/5 页 3 CN 114717341 A 3