(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210236477.4 (22)申请日 2022.03.11 (71)申请人 中国医学 科学院药用植物研究所 地址 100193 北京市海淀区马连洼北路151 号 (72)发明人 刘久石　齐耀东　魏雪苹　赵鑫磊　 罗丽　 (74)专利代理 机构 北京威禾知识产权代理有限 公司 11838 专利代理师 王月玲 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 额敏贝母与药材川贝母、 药材伊贝母的鉴别 方法 (57)摘要 本发明提供一种鉴别额敏贝母与药材川贝 母、 药材伊贝母的方法， 包括以待测样品DNA为模 板， 使用序列为SEQ  ID No.2的正向引物和序列 为SEQ ID No.3的反向引物， 进行扩增； 对扩增产 物进行测序并获得完整扩增片段； 将所述完整扩 增片段与SEQ  ID No.1相比对， 如果所述完整扩 增片段在相应于SEQ  ID No.1的5′端起第145位 为G、 第171位为T、 第172位为G， 则鉴定所述待测 样品为来自额敏贝母的样品； 如果所述完整扩增 片段， 在相应于SEQ  ID No.1的5′端起第145位为 T、 第171位为C、 第172位为A， 则鉴定所述待测样 品为来自药材川贝母或伊贝 母的样品。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图1页 CN 114457188 A 2022.05.10 CN 114457188 A 1.一种鉴别额敏贝母与药 材川贝母、 药 材伊贝母的方法， 其包括如下步骤： 1)以待测贝母样品DNA为模板， 使用正向引物和反向引物进行扩增， 得到扩增产物， 所 述正向引物包含SEQ  ID No.2的核苷 酸序列或由SEQ  ID No.2的核苷酸序列构成， 所述反向 引物包含SEQ ID No.3的核苷酸序列或由SEQ  ID No.3的核苷酸序列构成； 2)对所述扩增产物进行测序并获得完整扩增片段序列； 和 3)将所述完整扩增片段序列 与SEQ ID No.1进行序列比对， 其特征在于， a.如果所述完整扩增片段序列在相应于所述SEQ  ID No.1的5′端起第145位为G、 第171 位为T、 第172位 为G， 则鉴定所述待测贝母样品为 来自额敏贝母的样品； b.如果所述完整扩增片段序列在相应于所述SEQ  ID No.1的5′端起第145位为T、 第171 位为C、 第172位 为A， 则鉴定所述待测贝母样品为 来自药材川贝母或伊贝母的样品。 2.一种鉴定川贝母药 材或伊贝母药 材中是否混有额敏贝母的方法， 其包括如下步骤： 1)以来自待测药材的多个样品的DNA为模板， 使用正向引物和反向引物进行扩增， 得到 多个扩增产物， 所述正向引物包含SEQ  ID No.2的核苷酸序列或由SEQ  ID No.2的核苷酸序 列构成， 所述反向引物包含SEQ  ID No.3的核苷酸序列或由SEQ  ID No.3的核苷酸序列构 成； 2)对所述多个扩增产物进行测序并获得多个完整扩增片段序列； 和 3)将所述多个完整扩增片段序列分别与SEQ  ID No.1进行序列比对， 其特征在于， a.如果所述多个完整扩增片段序列在相应于所述SEQ  ID No.1的5′端起第145位均为 T、 第171位均为C、 第172位均为A， 则鉴定所述待测药 材为川贝母药 材或伊贝母药 材； b.如果所述多个完整扩增片段序列在相应于所述SEQ  ID No.1的5′端起第145位均为 G、 第171位均为T、 第172位均为G， 则鉴定所述待测药 材为额敏贝母； 以及 c.如果所述多个完整扩增片段序列中的至少一种在相应于所述SEQ  ID No.1的5′端起 第145位为G、 第171位为T、 第172位为G， 而至少另一种在相应于所述SEQ  ID No.1的5′端起 第145位为T、 第171位为C、 第172位为A， 则鉴定所述待药材为混有额敏贝母的川贝母 药材或 伊贝母药 材。 3.权利要求1或2所述的方法， 其中步骤2)还包括在对所述扩增产物进行测序后 拼接并 去除引物区。 4.权利要求1或2所述的方法， 其特 征在于所述样品为基原植物样品。 5.权利要求1或2所述的方法， 其特 征在于所述样品为药 材饮片样品。 6.引物对在制备检测剂中的用途， 所述引物对 包括正向引物和反向引物， 其中： 所述正向引物包 含SEQ ID No.2的核苷酸序列或由SEQ  ID No.2的核苷酸序列构成； 所述反向引物包 含SEQ ID No.3的核苷酸序列或由SEQ  ID No.3的核苷酸序列构成， 其特征在于， 所述检测剂用于 权利要求1至 5中任一项所述的方法。 7.用于权利要求1至5中任一项所述的方法的试剂盒， 所述试剂盒包含引物对， 所述引 物对包括正向引物和反向引物， 其中： 所述正向引物包 含SEQ ID No.2的核苷酸序列或由SEQ  ID No.2的核苷酸序列构成； 所述反向引物包 含SEQ ID No.3的核苷酸序列或由SEQ  ID No.3的核苷酸序列构成。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114457188 A 2额敏贝母与药材川贝母、 药材伊贝母的鉴别方 法 技术领域 [0001]本发明属于中药材来源品种鉴定技术领域， 具体涉及用SNP分子标记鉴定额敏贝 母与药材川贝母、 药材伊贝母的方法， 可以有效将额敏贝母与药材川贝母或药材伊贝母区 分开。 背景技术 [0002]贝母为我国一类传统药材， 具清热化痰、 止咳散结的功效， 其来源为百合科 Liliaceae贝母属Fritillaria多种植物干燥鳞茎。 贝母在临床配伍和中成药生产中使用广 泛， 如川贝枇杷露、 安嗽化痰丸、 蛇胆川贝液等。 2020版 《中国药典》 收载贝母类药材共5种： 川贝母、 伊贝母、 浙贝母、 湖北贝母、 平贝母， 5类贝母 药材基原 植物多达11种(含变种)。 正是 由于贝母类药材非单基原植物， 加之药用部位为鳞茎， 而贝母属同属物种鳞茎形态差异较 小， 所以贝母类药 材临床使用混伪现象较为常见。 [0003]额敏贝母F.meleagroides分布于新疆北部地区， 在当地额敏贝母鳞茎个头小者， 与药材川贝母相似， 在市场上使用和销售时较难区分； 个头大者与药材伊贝母相似， 在市场 上使用和销售时较难区分。 但额敏贝母并非药典收载川贝母或伊贝母的基原植物(药材川 贝母基原植物： 川贝母F.cirrhosa、 甘肃贝母F.przewalskii、 瓦布贝母F.wabuensis、 梭砂 贝母F.delavayi、 太白贝母F.taipaiensis、 暗紫贝母F.unibracteata； 药材伊贝母基原植 物： 伊犁贝母F.pallidiflora、 新疆贝母F.walujewii)。 市场上， 存在将额敏贝母个头小者 冒充为药材川贝母， 个头大者冒充为药材伊贝母的现象， 对药材川贝母、 药材伊贝母临床使 用的有效性、 一 致性造成很大影响。 [0004]针对上述混伪现象， 传统方法凭借经验区分， 难以准确鉴别， 因此， 亟需找到一种 稳定可靠的方法将额敏贝母与药材川贝母、 药材伊贝母加以鉴别区分， 以避免额敏贝母混 入上述贝母类药 材， 影响临床使用的有效性。 发明内容 [0005]额敏贝母与药材川贝母、 药材伊贝母的性状相似， 亲源关系较近， 采用性状鉴别等 传统鉴别方法难以区分， 无法快速可靠地实现对额敏贝母与药材川贝母、 药材伊贝母的鉴 别。 本发明通过分析多种不同贝母的核苷酸序列， 本发明人意外地发现在matK基因里面存 在特征性SNP， 通过扩增matK片段， 并鉴定所述SNP， 可以将额敏贝母与药材川贝母、 药材伊 贝母区分开来。 本发 明人确定了具体用以区分额敏贝母和药材川贝母、 药材伊贝母的SNP标 记位点。 [0006]本发明提供了额敏贝母与药 材川贝母、 药 材伊贝母鉴定用SNP标记位 点。 [0007]在一个实施方式中， 本发明提供一种来自额敏贝母的多核苷酸， 所述多核苷酸包 含如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。 [0008]在一个实施方式中， 本发明提供一种来自药材川贝母、 药材伊贝母的多核苷酸， 所 述多核苷酸包 含如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。说　明　书 1/6 页 3 CN 114457188 A 3