(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210244764.X (22)申请日 2022.03.11 (71)申请人 扬州大学 地址 225009 江苏省扬州市大 学南路88号 (72)发明人 陆金凯　钟磊　王莉　刘思安　 王庆杰　徐源　 (74)专利代理 机构 南京苏高专利商标事务所 (普通合伙) 32204 专利代理师 孙斌 (51)Int.Cl. C12N 15/29(2006.01) C12N 15/84(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C07K 14/415(2006.01)A01H 5/00(2018.01) A01H 6/00(2018.01) (54)发明名称 一种抑制银杏黄酮醇苷合成的关键基因 GbDAL1及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种抑制银杏黄酮醇苷合成 的关键基因GbDAL1及其应用， 所述关键基因 GbDAL1其核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 其表 达的蛋白的氨基酸序列如SEQ  ID NO.4所示。 本 发明在银杏中克隆得到GbDAL1基因， 发现GbDAL1 的表达和黄酮醇苷含量具有很高的相关性， 说明 GbDAL1是银杏中黄酮醇苷合成的关键调控基因。 通过将GbDAL1基因转入银杏和烟草体内， 过量表 达GbDAL1基因的转基因银杏中黄酮醇苷含量和 烟草中总黄酮含量都明显降低， 说明GbDAL1是抑 制黄酮醇苷合成的关键基因， 因此可以通过 CRISPR/CAS9基因编辑技术对GbDAL1基因进行敲 除从而提高黄酮醇苷产量。 权利要求书1页 说明书8页 序列表2页 附图4页 CN 114480429 A 2022.05.13 CN 114480429 A 1.一种抑制银杏黄酮醇苷合成的关键基因GbDAL1， 其特征在于， 所述基因GbDAL1的核 苷酸序列如SEQ  NO.1所示。 2.根据权利 要求1所述的抑制银杏黄酮醇苷合成的基因GbDAL1， 其特征在于， 用于扩增 所述基因GbDAL1的引物对为SEQ  ID NO.2:ATGGGACGAGGTCGAGTCC和SEQ  ID NO.3： AACCCACCACCCCGTGTAG。 3.一种权利要求1所述的抑制银杏黄酮醇苷合成的关键基因GbDAL1表达的蛋白， 其特 征在于， 所述蛋白的氨基酸序列如SEQ  ID NO.4所示。 4.一种含有权利要求1所述的抑制银杏黄酮醇苷合成的关键基因GbDAL1的表达载体。 5.根据权利 要求4所述的表达载体， 其特征在于， 所述表达载体在基因GbDAL1的5 ’端组 装了组成型启动子CaMV35S， 在基因GbDAL1的3 ’端组装了NOS ‑terminator； 所述表达载体组 装有NPTⅡ基因表达盒， 作为转基因银杏的筛选标记， 用卡那霉素进 行转基因银杏和烟草的 筛选。 6.根据权利要求4所述的表达载体， 其特征在于， 所述表达载体上组装有LB(T ‑Border  left)和RB(T ‑Border righ)序列， 促使组装于其间的GbDAL1基因表达框架和筛选标记基因 NPTⅡ整合至银杏染色体中。 7.一种含有权利要求1所述的抑制银杏黄酮醇苷合成的关键基因GbDAL1或者权利要求 2所述表达载体的宿主细胞。 8.一种权利要求1所述的抑制银杏黄酮醇苷合成的关键基因GbDAL1或者权利要求2所 述的表达蛋白在抑制银杏黄酮醇苷合成中的应用。 9.根据权利要求8所述的应用， 其特征在于， 所述黄酮醇苷优选包括银杏中槲皮素， 山 奈酚和异鼠李素。 10.一种权利要求1所述的抑制银杏黄酮醇苷合成的关键基因GbDAL1通过CRISPR/CAS9 基因编辑对GbDAL1基因进行敲除在提高黄酮醇苷产量中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114480429 A 2一种抑制银杏黄酮 醇苷合成的关键基因GbDAL1及其应用 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学技术领域， 具体涉及一种抑制银杏黄酮醇苷合成的关键基 因GbDAL1及其应用。 背景技术 [0002]银杏是一种重要的经济树种， 其叶子中含有丰富的活性化合物， 如黄酮类、 萜内 酯、 多糖和酚类。 银杏叶提取物(GbE)常用于治疗心血管、 神经退行性和衰老相关疾病等。 GbE已成为全球最受欢迎和广泛研究的草药制剂之一， 成为市场需求量巨大 的经济作物品 种。 黄酮类化合物是GbE中的主要生物活性 成分， 目前已从银杏叶中分离出40多种黄酮类化 合物， 包括黄酮、 黄酮醇、 黄烷酮和二氢黄酮醇等。 其中， 黄酮醇苷是GbE中最重要的黄酮类 物质， 在药典中明确规定， GBE中的黄酮醇苷含量要达到24％以上才能用于药用。 因此， 银杏 叶片中的黄酮醇苷含量决定 了银杏叶片的质量。 [0003]目前， 对于黄酮醇苷合成的研究大多集中在其合成通路 中相关基因的研究。 此外， 最近几年越来越多的研究发现一些关键的转录因子， 如MYB、 bHLH等正 向调控黄酮醇合成。 黄酮醇合成的正向调节因子已经得到了广泛的研究， 而对于负调控黄酮醇合成转录因子的 研究仍然知之甚少。 了解银杏叶片中黄酮醇合 成的负调节因子， 对于未来通过CRISPR/CAS9 基因编辑技术对基因进行定点敲除从而在提高黄酮醇苷提供了宝贵参考价值。 此外， 对于 进一步展开银杏黄酮合成机制研究具有重要意 义 发明内容 [0004]发明目的： 针对现有技术中存在的不足， 本发明提供一种抑制 银杏黄酮醇苷合成 的关键基因GbDAL1， 该基因为调控银杏叶片中黄酮醇苷合成的关键负调控因子， 通过促进 该基因的表达能够抑制银杏中槲皮素， 山奈酚和异鼠李素 的含量， 从而负调控或者抑制银 杏叶片中的黄酮醇苷的合成。 [0005]本发明还提供了所述的抑制银杏黄酮醇苷合成的关键基因GbDAL1表达的蛋白、 载 体及其应用。 [0006]技术方案： 为了实现上述目的， 本发明所述一种抑制银杏黄酮醇苷合成的关键基 因GbDAL1， 所述基因GbDAL1的核苷酸序列如SEQ  NO.1所示。 [0007]作为优选 ， 用于扩 增所述基因G bDAL1的 引物对为SEQ  ID NO .2: ATGGGACGAGGTCGAGTC C和SEQ ID NO.3： AACCCACCACCCCGTGTAG。 [0008]本发明所述的抑制银杏黄酮醇苷合成的关键基因GbDAL1表达的蛋白， 其特征在 于， 所述蛋白的氨基酸序列如SEQ  ID NO.4所示。 [0009]本发明所述的抑制银杏黄酮醇苷合成的关键基因GbDAL1的表达载体。 [0010]其中， 所述表达载体在基因GbDAL1的5 ’端组装了组成型启动子CaMV35S， 它 能使 GbDAL1基因在银杏和烟草体内高效表达。 在基因GbDAL1的3 ’端组装了NOS ‑terminator； 所 述表达载体组装有NPT Ⅱ基因表达盒， 作为转基因银杏的筛选标记， 用卡那霉素进 行转基因说　明　书 1/8 页 3 CN 114480429 A 3