(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210237489.9 (22)申请日 2022.03.11 (71)申请人 浙江大学 地址 310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘 路866号 (72)发明人 毛姗姗　周栋明　姚妹　 (74)专利代理 机构 上海光华专利事务所(普通 合伙) 31219 专利代理师 王秋霞　许亦琳 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于检测叶酸代谢相关SNP标记的引物组及 试剂盒 (57)摘要 本发明涉及基因检测技术领域， 特别是涉及 用于检测叶酸代谢相关SNP标记的引物组及试剂 盒， 所述引物组包括第一扩增引物组或第一延伸 引物组， 所述第一扩增引物组包括核苷酸序列如 SEQ ID NO:3～8所示的引物， 所述第一延伸引物 组包括核苷酸序列如SEQ  IDNO:10～12所示的引 物。 本发明还提供用于联合检测叶酸代谢相关 SNP标记和脊肌萎缩症相关基因拷贝数变异的引 物组， 所述引物组包括所述第一扩增引物组和第 二扩增引物组， 以及所述第一延伸引物组和第二 延伸引物组， 所述第二扩增引物组的包括核苷酸 序列如SEQ  IDNO:1～2所示的引物， 所述第二延 伸引物组包括核苷酸序列如SEQ  ID NO:9所示的 引物。 权利要求书1页 说明书10页 序列表2页 附图6页 CN 115058507 A 2022.09.16 CN 115058507 A 1.用于检测叶酸代谢相关SNP标记的引物 组， 其特征在于， 所述引物 组包括第 一扩增引 物组或第一延伸引物组， 所述第一扩增引物组包括核苷 酸序列如S EQ ID NO:3～8所示的引 物， 所述第一延伸引物组包括核苷酸序列如SEQ  ID NO:10～12所示的引物。 2.根据权利要求1所述的引物组， 其特征在于， 所述叶酸代谢相关SNP标记包括 MTHFRA12 98C、 MTHFR  C677T和MTRR A66G。 3.权利要求1或2所述的引物组在制备检测叶酸代谢相关SNP标记产品中的用途。 4.一种用于检测叶酸代谢相关SNP标记的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括权利要 求1或2所述的引物组。 5.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括PCR扩增反应试剂、 碱 性磷酸酶处 理试剂或单碱基延伸反应试剂。 6.根据权利要求5所述的试剂盒， 其特 征在于， 还 包括以下 特征中任一项或多 项： 1)所述PCR扩增反应试剂包括DNA聚合酶， PCR缓冲液， dNTP混合物和水性介质； 2)所述碱性磷酸酶处 理试剂包括SAP、 水性介质和缓冲液； 3)所述单碱基延伸反应试剂包括 iPLEX酶、 缓冲液、 水性介质和终止液； 4)所述试剂盒还 包括用于从样品中提取基因 组DNA的试剂。 7.用于联合检测叶酸代谢相关SNP标记和脊肌萎缩症相关基因拷贝数变异 的引物组， 其特征在于， 所述引物组包括权利要求1或2所述的引物组， 以及第二扩增引物组和第二延 伸引物组； 所述第二扩增引物组的包括核苷酸序列如SEQ  ID NO:1～2所示的引物， 所述第 二延伸引物组包括核苷酸序列如SEQ  ID NO:9所示的引物。 8.根据权利要求7所述的引物 组， 其特征在于， 所述脊肌萎缩症相关基因拷贝数变异位 点包括SMN1E7:NM_0 01297715.1:c.840T或SMN2  E7:NM_02 2875.3:c.840T。 9.权利要求7或8所述的引物 组在制备联合检测叶酸代谢相关SNP标记和脊肌萎缩症相 关基因拷贝数变异产品中的用途。 10.用于联合检测叶酸代谢相关SNP标记和脊肌萎缩症相关基因拷贝数变异的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂盒中包括权利要求7或8所述的引物组。 11.根据权利要求10所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中还包括PCR扩增反应试 剂、 碱性磷酸酶处 理试剂或单碱基延伸反应试剂。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115058507 A 2用于检测叶酸代谢相关SNP标记的引物组及 试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及基因检测技术领域， 特别是涉及用于检测叶酸代谢相关SNP标记的引 物组及试剂盒。 背景技术 [0002]SMA(spinal  muscular  atrophy,脊肌萎缩症)是一种常染色体隐性遗传性进 行性 运动神经元病， 以脊髓前角细胞和脑干运动性脑神经核的进行性变性为主要特征。 临床主 要表现为进行性、 对称性肌无力和萎缩， 近端重于远端， 下肢重于上肢。 该病患儿在新生儿 中约占1/10000， 而致病基因携带者约占1/50。 根据发病年龄和临床表现可分为4型， 分别为 小于6个月 起病的脊肌萎缩症 Ⅰ型(spinal  muscular  atrophy  typeⅠ,SMN1， 也称作 Werdnig ‑Hoffmann  disease)、 6～18个月起病的脊肌萎缩症 Ⅱ型(spinal  muscular   atrophy typeⅡ,SMN2)、 儿童期或青少年起病的脊肌萎缩症 Ⅲ型(spinal  muscular   atrophy typeⅢ,SMA3， 也称作Kugelh erg‑Welander  disease)和成年起病的脊肌萎缩症 Ⅳ 型(spinal  muscular  atrophy type  Ⅳ,SMA4)。 4种亚型的SMA致病基因相同， 均 为运动神 经元存活基因1(surv ival motor neuronl,SMN1)[OMIM600354 ]。 SMN1基因位于5号染色体， 全长约20kb， 含9个外显子。 与其紧邻的SMN2和SMN1高度同源， 仅有5个核苷酸的差异。 SMN2 为调节基因， 其拷贝数与SMA的病情严重程度成反比。 [0003]叶酸是机体所需的重要营养素， 为水溶性B族维生素， 参与一系列涉及一碳单位转 运的重要生化反应。 叶酸是合成核酸所必须的元素， 是细胞生长和组织修复所必备的物质， 更是胚胎发育过程中不可缺少的营养素。 叶酸摄入不足或叶酸代谢障碍， 是新生儿缺陷的 重要因素， 不仅如此， 叶酸缺乏所引起的高同型半胱氨酸(HCY)血症还会引起母亲早产、 妊 娠期高血压等疾病； 叶酸摄入不 足或叶酸代谢障碍对于父亲会导致男性生殖能力降低等不 利影响； 对于高血压病人， 会导致 “H”型高血压， 从而增加发生脑卒中的风险。 因此， 合理补 充叶酸， 降低血液中HCY浓度， 是避免脑 卒中发生的有效措施。 MTHFR基因的A1298C位点A →C 突变、 C677T位点C →T突变和MTRR基因的66A →G突变后会影响叶酸代谢相关酶活性， 导致叶 酸利用效率降低， 易引起叶酸 缺乏， 增加神经管缺陷等疾病的风险。 [0004]现有技术中MLPA、 RT ‑PCR或NGS一定程度能够用于SMA和叶酸相关基因突变， 但具 有一定的缺点。 MLPA相关检测能够区分SMA患者、 携带者及正常人， 检测患者的SMN2拷贝 数， 同时检测叶酸代谢3个相关突变位点， 但是该技术样 本要求高， 通量有限， 流程较为复杂； 通 过采集荧光获取信号， 容易造成信号偏差； 同时不能检测点突变， 成本也较高。 RT ‑PCR可以 区分SMA患者、 携带者、 正常人， 对设备要求不高， 且检测流程快， 检测 速度较其他两种方法 快。 但RT‑PCR信号判读是利用荧光信号的扩增， 容易造成荧光干扰。 NGS技术不仅可以定向 检出SMA， 还 可以同时覆盖其他相关表型的类似肌病。 但NGS只能作初筛， 疑似阳性的结果还 需要进行MLPA等方法验证。 在SMN2拷贝数分析 方面NGS准确性和可靠性低， 成本高。说　明　书 1/10 页 3 CN 115058507 A 3