(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210234941.6 (22)申请日 2022.03.11 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114317728 A (43)申请公布日 2022.04.12 (73)专利权人 北京贝瑞和康生物技 术有限公司 地址 102299 北京市昌平区科技园区生命 园路4号院5号楼8层801 (72)发明人 李佳琪　卢玉林　孟万利　詹嘉晗　 毛爱平　张丽　任志林　 (74)专利代理 机构 北京市金杜律师事务所 11256 专利代理师 孟凡宏　袁森 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01)C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) 审查员 陈皓 (54)发明名称 用于检测SMA中多种突变的引物组、 试剂盒、 方法和系统 (57)摘要 本发明涉及用于检测SMA中多种突变的引物 组、 试剂盒、 方法和系统， 其中所述用于检测SMA 疾病相关基因突变的方法包括以下步骤： （1） 提 供受试者基因组DNA样本； （2） 用引物组通过PCR 扩增所述基因组DNA样本中的SMN基因； （3） 构建 三代测序文库； 和 （4） 进行三代测序并分析基因 突变类型。 权利要求书2页 说明书19页 序列表3页 附图4页 CN 114317728 B 2022.06.07 CN 114317728 B 1.用于扩增 SMN基因的引物组， 其中所述引物组包 含如下引物： SMN‑FL‑F与SMN‑FL‑R； 以及 SMN‑DOWN‑F与SMN‑DOWN‑R； 其中所述引物组中SMN ‑FL‑F位于SMN1和SMN2基因上游的同源区域， SMN ‑FL‑R位于SMN1 和SMN2的7号外显子c.840下游的同源区域， SMN ‑FL‑F和SMN‑FL‑R扩增长度不超过35kb； SMN‑DOWN‑F位于SMN1和SMN2的7号外显子c.840上游的同源区域， SMN ‑DOWN‑R位于SMN1和 SMN2基因下游的同源区域， SMN ‑DOWN‑F和SMN‑FL‑R扩增长度不超过3 5kb； 其中所述引物SMN ‑FL‑F选自SEQ  ID NOs： 1‑4， SMN‑FL‑R选自SEQ  ID NOs： 5‑8， SMN‑ DOWN‑F选自SEQ  ID NOs： 9‑12， SMN‑DOWN‑R选自SEQ  ID NOs： 13‑16。 2.根据权利要求1所述的引物 组， 其中所述引物组 的扩增产物用于构建三代测序文库， 并通过三代测序同时检测 SMN1与SMN2的拷贝数和点突变， 以及 SMN1 (2 + 0)沉默携带者， 其中点突变至少包 含如表1所示的 SMN1基因上的190种点 突变。 3.根据权利要求2的引物组， 其中所述引物 组的扩增产物用于构建三代测序文库， 并通 过三代测序检测扩增产物中同一扩增片段内的不同突变是否连锁。 4.根据权利要求1所述的引物组， 其中所述引 物可在5’端加上5‑50nt不同序列的DNA， 即DNA条形码， 以区分不同样本 。 5.根据权利要求2所述的引物组， 其 中所述三代测序选自Pacific  Biosciences公司的 PacBio测序或Oxford  Nanopore Technologies （ONT） 的Nan opore测序。 6.用于扩增 SMN基因的试剂盒， 其包含DNA聚合酶、 反应缓冲液和根据权利 要求1‑5中任 一项所述的引物组。 7.用于检测SMA疾病相关基因突变的装置， 其包 含： 根据权利要求6所述的用于扩增 SMN基因的试剂盒； 和 用于构建三代测序文库的试剂盒。 8.根据权利要求7所述的装置， 其中所述用于构建三代测序文库的试剂盒包括末端修 复酶、 接头、 连接酶、 DNA纯化磁珠、 反应缓冲液和外切酶。 9.用于检测SMA疾病相关基因突变的系统， 包括以下模块： （1） 采集模块， 其用于提供受试者基因 组DNA样本； （2） 扩增模块， 其用于用根据权利要求1 ‑5中任一项所述的引物组通过PCR扩增所述基 因组DNA样本中的 SMN基因， 其中所述 SMN基因包括 SMN1，SMN2以及SMN1和SMN2的融合基因； （3） 文库构建模块， 其用于构建三代测序文库； （4） 测序分析模块， 其用于三代测序并分析基因突变 类型。 10.根据权利要求9所述的系统， 其中所述扩增模块包括 根据权利要求7 所述的试剂盒。 11.根据权利要求9所述的系统， 其中所述文库构建模板包括用于构建三代测序文库的 试剂， 所述用于构建三代测序文库的试剂包括接头、 连接酶、 DNA纯化磁珠、 反应缓冲液和外 切酶。 12.根据权利要求9所述的系统， 其中所述三代测序选自Pacific  Biosciences公司的 PacBio测序或Oxford  Nanopore Technologies （ONT） 的Nan opore测序。 13.根据权利要求9所述的系统， 其中通过测序分析模块进行三代测序并分析基因突变 类型后， 可以同时检测的SMA疾病相关基因突变包括 SMN1与SMN2的拷贝数和点突变， 以及权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114317728 B 2SMN1 (2 + 0)沉默携带者， 其中点突变至少包含如表1所示的 SMN1基因上的190种点突变以 及其中不同突变之间是否连锁。 14.根据权利要求1 ‑5中任一项所述的引物 组在制备用于检测SMA疾病相关基因突变的 试剂盒中的用途。 15.根据权利要求14所述的用途， 其中所述用于检测SMA疾病相关基因突变包括以下步 骤： （1） 提供受试者基因 组DNA样本； （2） 用根据权利要求1 ‑5中任一项所述的引 物组通过PCR扩增所述基因组DNA样本中的 SMN基因； （3） 构建三代测序文库； 和 （4） 进行三代测序并分析基因突变 类型。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114317728 B 3