(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210235474.9 (22)申请日 2022.03.11 (71)申请人 杭州师范大学 地址 311121 浙江省杭州市余杭区余杭塘 路2318号 (72)发明人 孔娜　吴功伟　周君　 (74)专利代理 机构 杭州君度专利代理事务所 (特殊普通 合伙) 33240 专利代理师 朱亚冠 (51)Int.Cl. C12N 15/66(2006.01) C12N 15/85(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种高效稳定环状RNA的构建方法及其产品 (57)摘要 本发明公开一种高效稳定环状RNA的构建方 法及其产品。 本发明开发的环状RNA制备方法能 够快速高效制备可表达特定蛋白质的环状RNA。 具体地， 环 状RNA的通用模板质粒pCR可用于构建 任意表达蛋白的载体， 只需要合成需要表达蛋白 的对应DNA片段， 通过重组即可得到环状RNA的特 定DNA模板。 本发明采用一型内含子自我剪接原 理， 通过设计特殊的高效剪接成环序列， 只需要 在RNA中添加 GTP和Mg2+即可在37℃15分钟内成 环， 本发明方法相比于溴化氰或者T4连接酶(等 成环方法， 具有试剂价格便宜易购买、 简单高效、 试剂无毒性的特点。 权利要求书2页 说明书7页 序列表2页 附图2页 CN 114875053 A 2022.08.09 CN 114875053 A 1.一种用于合成环状RNA的目的模板质粒pCR的构建方法， 其特 征在于包 含以下步骤： (1)在通用质粒上按顺序分别插入T7启动子、 5 ’端一型内含子配对序列、 CVB3IRES序 列、 翻译增强元件、 两个限制性内切酶位点、 poly  A序列和3 ’端一型内含子配对序列， 构建 合成环状RNA的通用模板质粒pCR； 其中两个限制性内切酶之间插入需编码蛋白的序列； 所 述两个限制性内切酶为BamH  I和Xho I； (2)将通用模板质粒进行对应限制性内切酶双酶切， 获得线性载体， 用于后续构建目的 pCR； (3)设计包含DNA重组序列的引 物， 并通过高保真DNA聚合酶进行PCR扩增， 获得表达目 的蛋白质相对应的目的DNA片段； (4)将步骤(2)双酶切后的线性载体和步骤(3)目的DNA片段混合进行DNA重组， 获得插 入目的DNA的pCR载体； (5)将插入目的DNA的pCR载体进行转 化和克隆筛 选、 质粒提取和 测序验证。 2.如权利要求1所述的方法， 其特征在于DNA重组过程中步骤(2)双酶切后的线性载体 和步骤(3)目的DNA片段的碱基序列长度比为1： 2 ‑5。 3.一种环状RNA的体外大规模制备 方法， 其特 征在于包 含以下步骤： (1)利用权利要求1所述方法制备 得到的目的模板质粒pCR合成线性RNA； (2)采用一型内含子自我剪接原理， 将体外合成的线性RNA环化得到环状RNA； 具体如 下： 将线性RNA加热到70℃反应5分钟， 再将RNA放置于冰上静置3分钟， 以解除RNA的多级结 构； 然后将RNA加入到环化反应体系： 2mM  GTP， 10mM  MgCl2， 50mM pH 7.5Tris ‑HCl， 1mM  DTT， 55℃环化反应15分钟即可 得到环状RNA； (3)将上述环状RNA进行乙醇沉淀纯化， 用不含脫氧核糖核酸酶和不含核糖核酸酶的水 溶解获得环化后的RNA； (4)重复步骤(2) ‑(3)进行再次环化； (5)采用高效液相色谱法将环化后的RNA进行纯化， 根据具体环状RNA出峰时间， 收集环 状RNA； (6)将上述收集的环状RNA用乙醇沉淀法纯化， 最后用不含脫氧核糖核酸酶和不含核糖 核酸酶的水 溶解获得环状RNA。 4.如权利要求3所述的方法， 其特 征在于步骤(1)具体是： 1‑1设计可扩增包含从T7启动子到3 ’端一型内含子配对序列完整序列的引物， 以权利 要求1所述方法制备得到的目的模板质粒pCR作为DNA模板， 通过高保真DNA聚合酶进行PCR 扩增获得用于合成RNA的目的线性DNA； 1‑2将目的线性DNA进行PCR产物纯化； 1‑3以纯化后目的线性DNA为模板， 采用T7  RNA聚合酶进行体外合成； 1‑4在转录完成后的RNA体系中加入脫氧核糖核酸酶I去除DNA模板； 1‑5采用乙醇沉淀法进行纯化， 用不含脫氧核糖核酸酶和不含核糖核酸酶的水溶解获 得线性RNA。 5.如权利要求4所述的方法， 其特征在于可扩增包含从T7启动子到3 ’端一型内含子配 对序列完整序列的引物具体是： Forward引物序列： gacccaagctttaatacgac； Reverse引物序权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114875053 A 2列： cctctagactagatatgctg。 6.一种用于合成环状RNA的目的模板质粒pCR， 其特征在于采用如权利要求1或2所述方 法构建得到 。 7.一种环状RNA， 其特 征在于采用如权利要求3 ‑5任一项所述方法构建得到 。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114875053 A 3