(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210237894.0 (22)申请日 2022.03.11 (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大 道1800号 申请人 苏州市产品质量 监督检验院 (72)发明人 郭亚辉　沈维韦　桑潘婷　丁洪流　 金萍　谢云飞　姚卫蓉　 (74)专利代理 机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权 代理有限公司 2321 1 专利代理师 林娟 (51)Int.Cl. G01N 33/53(2006.01) G01N 33/74(2006.01) G01N 33/577(2006.01)G01N 33/58(2006.01) G01N 33/533(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种基于人工核酶的食品中污染物多色荧 光分析方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于人工核酶的食品中 污染物多色荧光分析方法， 属于分子生物学检测 领域。 本发明以金纳米颗粒为载体， 合成AuNPs ‑ DNA‑抗体检测探针， 抗体用于捕获目标物， 引物 DNA用于放大信号。 在最佳条件下， 本发明的方法 实现了CAP、 17β ‑E2和AFM1的同时检测， 检测范 围分别为0.333ng/mL ‑3.333μg/mL、 3.333ng/ mL‑3.333μg/mL、 3.333fg/mL ‑3.333ng/mL， 定 量 限分别为0.333ng/mL、 3.333ng/mL、 3.333fg/mL。 本发明检测准确度、 灵敏度和稳定性较高， 相比 现有技术， 本发明建立的方法在检测过程中， 无 需添加额外的核酸外切酶， 降低反应成本 。 权利要求书1页 说明书8页 附图5页 CN 114544932 A 2022.05.27 CN 114544932 A 1.一种同时检测多种污染物的方法， 其特 征在于， 所述方法的具体步骤为： (1)合成检测探针： 在AuNP s表面修饰氯霉素、 雌二醇激素或黄曲霉毒素M1的引物DNA和 相应的特异性 抗体， 分别得到针对氯霉素、 雌二醇激素、 黄曲霉毒素M1的三种检测探针； (2)将氯霉素、 雌二醇激素、 黄曲霉毒素M1相应抗原进行混合并添加至黑色聚苯乙烯微 孔板， BSA封闭； (3)将步骤(1)制备的氯霉素、 雌二醇激素、 黄曲霉毒素M1的检测探针分别稀释后与待 测样品混合后加入至步骤(2)中的黑色聚苯乙烯微 孔板， 孵育并清洗黑色聚苯乙烯微 孔板； (4)将针对氯霉素、 雌二醇激素、 黄曲霉毒素M1的信号DNA和 Mg2+分别加入至步骤(3)中 的黑色聚苯乙烯微 孔板， 孵育并检测荧 光强度信号。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 氯霉素 的引物DNA的序列为： 5 ’ ‑HS‑(T)28T CTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGCGT ‑3’； 雌二醇激素的引物DNA的序列为： 5 ’ ‑HS‑(T)28GATT GTCTCCGAGCCGGTCGAAATGAAGCTA ‑3’； 黄曲霉毒素M1的引物DNA的序列为： 5 ’ ‑HS‑(T)28GCTAC TCTCCGAGCCGGTCGAAATTAGAACG‑3’。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 氯霉素的信号DNA的序列为： 5 ’ ‑FAM‑ ACGCACTAT/rA/GGAAGAGAT ‑BHQ1‑3’， 雌二醇激素的信号DNA的序列 为： 5’ ‑Cy3‑TAGCTTCAT/ rA/GGACAATCA‑BHQ2‑3’， 黄曲霉毒素M1的信号DNA的序列为： 5 ’ ‑Texas red‑CGTTCTAAT/rA / GGAGTAGCC‑BHQ2‑3’。 4.根据权利 要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 将氯霉素、 雌二醇激素、 黄曲霉 毒素M1相应抗原进 行混合并添加至黑色聚苯乙烯 微孔板， 35～38℃下孵育1.5～2.5h， 加入 220 μL 2％BSA在3 5～38℃下封闭0.5～1.5 h。 5.根据权利要求1或4所述的方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 氯霉素、 雌二醇激素、 黄曲 霉毒素M1相应抗原的添加浓度为0.6～1.5 μg/mL。 6.根据权利 要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤(3)中， 氯霉素、 雌二醇激素、 黄曲霉毒 素M1的检测探针的稀释倍数为1/80 ‑1/60。 7.根据权利 要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤(4)中， 氯霉素、 雌二醇激素、 黄曲霉毒 素M1的信号DNA的添加浓度为0.01～0.1 μg/mL， Mg2+的浓度为5～15mM 。 8.一种多色荧光检测试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包括针对氯霉素、 雌二醇激素和 黄曲霉毒素M1的检测探针、 包被有氯霉素、 雌二醇激素和黄曲霉毒素M1包被抗原的黑色聚 苯乙烯微孔板、 BSA、 氯霉素标准品、 雌二醇激素标准品、 黄曲霉毒素M1标准品、 信号DNA和 Mg2+。 9.根据权利要求8所述的多色荧光检测试剂 盒， 其特征在于， 所述检测探针的制备方法 为： 取一定量的AuNPs， 加入氯霉素、 雌二醇激素或黄曲霉毒素M1单克隆抗体， 室温孵育， 形 成三种AuNPs ‑抗体分散液； 巯基修饰的氯霉素、 雌二醇激素或黄曲霉毒素M1的引物DNA经 TCEP活化后分别加入对应AuNPs ‑抗体分散液， 混匀并冷冻， 溶解后加入PEG20000和PBS， 获 得AuNP‑DNA‑抗体分散液； 加入BSA进行孵 育， 离心取 上清获得检测探针。 10.根据权利要求8或9所述的多色荧光检测试剂盒， 其特征在于， 氯霉素的信号DNA 的 序列为： 5’ ‑FAM‑ACGCACTAT/rA/GGAAGAGAT ‑BHQ1‑3’， 雌二醇激素的信号DNA的序列 为： 5’ ‑ Cy3‑TAGCTTCAT/rA/GGACAATCA ‑BHQ2‑3’， 黄曲霉毒素M1的信号DNA的序列为： 5 ’ ‑Texas  red‑CGTTCTAAT/rA/GGAGTAGCC‑BHQ2‑3’。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114544932 A 2一种基于人工核酶的食品中污染物多色荧光分析方 法 技术领域 [0001]本发明涉及 一种基于人工核酶的食品中污染物多色荧光分析方法， 属于分子生物 学检测领域。 背景技术 [0002]近年来随着人们生活质量与观念水平的提高， 牛奶已经逐渐成为家庭中的必需 品， 牛奶营养丰富， 但有资料显示现代牛奶中抗生素、 雌激素、 微生物毒 素含量增加， 长时间 摄入可能危害着人类健康尤其是对青少年生长发育和 生殖系统有不利影响。 因此， 监测食 品中污染物的含量对于确保食品安全至关重要。 迄今为止， 已经开发了多种分析检测方法 用于联合检测食品中的污染物， 包括仪器分析法和酶联免疫法(ELISA)。 然而， 这些方法可 能预处理步骤繁琐、 交叉反应较强等缺点。 因此， 有必 要开发一种简单高效的多色荧光检测 方法。 [0003]AuNPs‑DNA‑抗体是一种将纳米材料和免疫 分析方法相结合的检测探针， 其中抗体 用于免疫竞争靶标， trigger  DNA用于扩增信号。 目前， 该探针已被广泛应用到生物传感器 领域。 此外， 很多基于DNAz yme的等温扩增技术也是近年来研究的热点。 DNAzyme是一类具有 催化功能的DNA分子。 同蛋白质和RNA催化酶一样， DNAzyme能够催化多种 类型的生化反应， 并在不对称催 化、 生物传感器、 DNA纳米技术以及临床诊断方面得到了广泛的应用。 综上， 结 合AuNPs‑DNA‑抗体特异性检测探针与DNAzyme介导的核酸扩增(DANA)， 根据检测探针设计 的不同荧 光素信号， 实现食品中不同痕量污染物的高灵敏度检测分析。 发明内容 [0004][技术问题] [0005]解决荧光免疫法同时检测多种污染物的问题， 提供一种多色荧光高灵敏检测的便 捷方法。 [0006][技术方案] [0007]本发明的第一个目的是提供一种同时检测多种污染物的方法， 所述方法的具体步 骤为： [0008](1)合成检测探针： 在AuNPs表面修饰氯霉素(CAP)、 雌二醇激素(17β ‑E2)或黄曲霉 毒素M1(AFM1)的引物DNA和相应的特异性抗体， 分别得到针对CAP、 17β ‑E2、 AFM1的三种检测 探针； [0009](2)将CAP、 17β ‑E2、 AFM1相应抗原进行混合并添加至黑色聚苯乙烯微孔板， BSA封 闭； [0010](3)将步骤(1)制备的CAP、 17β ‑E2、 AFM1的检测探针分别稀释后与待测样品混合后 加入至步骤(2)中的黑色聚苯乙烯微 孔板， 孵育并清洗黑色聚苯乙烯微 孔板； [0011](4)将针对CAP、 17β ‑E2、 AFM1的信号DNA和Mg2+分别加入至步骤(3)中 的黑色聚苯乙 烯微孔板， 孵育并检测荧 光强度信号。说　明　书 1/8 页 3 CN 114544932 A 3