(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210237973.1 (22)申请日 2022.03.10 (71)申请人 山东省滨州畜牧兽医研究院 地址 256600 山东省滨州市滨 城区黄河二 路169号绿都生物工程高科技园 (72)发明人 于新友　王文秀　李天芝　唐娜　 刘博　谢金文　谷英华　 (74)专利代理 机构 重庆航图知识产权代理事务 所(普通合伙) 50247 专利代理师 王贵君 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 用于同时检测PEV和P TV的直接扩增荧光RT- PCR引物探 针组和试剂盒及方法 (57)摘要 本发明公开了一种用于同时检测PEV和PTV 的直接扩增荧光RT ‑PCR引物探针组和试剂盒及 方法， 所述引物探针组包括4条不同的引物和2条 不同的探针， 其中， 2条扩增PEV的引物， 其核苷酸 序列如SEQ  ID NO.1～2所示； 1条扩增PEV的探针 序列， 其核酸序列如SEQ  ID NO.5所示； 2条扩增 PTV的引物， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.3～4所 示； 1条扩增P TV的探针序列， 其核苷酸序列如SEQ   ID NO.6所示， 可用于直接扩增荧光RT ‑PCR同时 检测PEV和P TV， 具有操作 简单、 灵敏度高、 特异性 好、 检测速度快， 成本低等显著优势， 适宜临床大 规模推广应用， 具有良好的推广价值和应用前 景。 权利要求书1页 说明书7页 序列表3页 附图2页 CN 114574632 A 2022.06.03 CN 114574632 A 1.一种用于同时检测 PEV和PTV的直接扩增荧光RT ‑PCR引物探针组， 其特征在于， 包括4 条不同的引物和2条不同的探针， 其中， 2条扩增PEV的引物， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.1～ 2所示； 1条扩增PEV的探针序列， 其核酸序列如SEQ  ID NO.5所示； 2条扩增PTV的引物， 其核 苷酸序列如SEQ  ID NO.3～4所示； 1条扩增PTV的探针序列， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.6所 示。 2.根据权利要求1所示的引 物探针组， 其特征在于， SEQ  ID NO.5序列所示探针的5 ′端 标记荧光基团FAM， 3 ′端标记淬灭基团BHQ1。 3.根据权利要求1所示的引 物探针组， 其特征在于， SEQ  ID NO.6序列所示探针的5 ′端 标记荧光基团HEX， 3′端标记淬灭基团BHQ1。 4.一种含有权利要求1所述的引物探针组的试剂盒， 其特 征在于， 包括如下 试剂： (1)RT‑PCR反应液： PrimeDirect  Probe RT‑qPCR Mix； (2)引物、 探针预混合液： SEQ  ID NO.1～4所示引物， SEQ  ID NO.5～6所示探针的混合 液； (3)阳性对照： 阳性对照为灭活的PEV和PTV病毒液等体积混合液； (4)阴性对照： 纯化水。 5.根据权利 要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 所述引物探针预混合液中， SEQ  ID NO.1 ～4所示引物分别按8： 13： 12： 14的体积混合， SEQ  ID NO.5～6所示探针按6： 7的体积混合， SEQ ID NO.1～4所示引物的配制浓度均为15 μmol/L， SEQ  ID NO.5～6所示探针的配制浓度 均为10 μmo l/L。 6.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 所述阳性对照中， 灭活前PEV病 毒液病毒 含量为102.71TCID50/100 μL， PTV病毒液病毒含量 为102.54TCID50/100 μL。 7.使用权利要求4～6任一项所述的试剂盒同时检测PEV和PTV的方法， 其特征在于， 包 含如下步骤： 取待测猪的肠道内容物或粪便作为样本， 按1： 5加入生理盐水， 搅拌混匀， 12   000r/min离心2min， 取上清作为模板， 加 入权利要求4～6任一项所述的试剂盒中的RT ‑PCR 反应液和引物、 探针预混合液进行直接扩增荧 光RT‑PCR。 8.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述直接扩增荧光RT ‑PCR的反应程序为： 90℃裂解3mi n； 60℃反转录 5min； 95℃变性5s， 52℃退火20s， 此处收集 荧光， 共计40个 循环。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114574632 A 2用于同时检测PEV和PTV的直接 扩增荧光RT ‑PCR引物探针组和 试剂盒及方 法 技术领域 [0001]本发明涉及分子生物学检测技术领域， 具体涉及一种用于同时检测PEV和PTV的直 接扩增荧 光RT‑PCR引物探针组和试剂盒及方法。 背景技术 [0002]猪肠道病毒(porcine  enteroviruse， P EV)是小RNA病毒 科、 肠道病毒属， 病毒粒子 呈圆形， 无囊膜， 基因组为单股 正链RNA。 PEV仅能感染猪， 各品种和日龄猪均可感染发病， 多 呈散发。 PEV引起的肠道病毒病临床症状可表现为腹泻、 呼吸道疾病、 神经症状及繁殖障碍 等。 能垂直传播 也能水平传播， 给养猪业造成严重的经济损失。 [0003]猪捷申病毒(porcine  teschovirus， PTV)是小RNA病毒科、 捷申病毒属， 病毒粒子 呈球形， 无囊膜， 基因组为单股正链RNA。 PTV唯一宿主是猪， 引起的猪捷申病毒病长期以来 一直被忽视， 呈地方流行性。 各品种和日龄猪均可感染发病， 主要临床表现为脑脊髓灰质 炎、 繁殖障碍、 肺炎、 下痢、 心包炎和心肌炎、 皮肤损伤等等。 PTV还具有持续感染的特性， 猪 群感染康复后可长期带毒， 排毒期长 达3个月， 给养猪业造成了严重的经济损失。 [0004]荧光PCR技术以其无可比拟的优势广 泛应用于猪病检测中， 传统荧光PC R检测需要 病原核酸提取步骤， 操作繁琐， 增加了实验室气溶胶污染的概率， 且 可能因提取操作不慎导 致检测假阴性或假阳性结果， 对实验室条件要求较高。 随着分子生物技术的不断发展， 一些 生物试剂公司已经开发出了直接扩增荧光PCR扩增试剂， 试剂有耐高温的酶制剂和促使病 毒高温裂解的试剂组分， 已经应用新型冠状病毒检测中， 但在兽医领域相关报道较少。 一种 病原核酸检测方法建立除试剂 外， 引物和探针是最关键的部 分， 尤其多重荧光P CR检测病原 的方法尚未成熟， 对多种荧光P CR检测引物和探针的设计并不容易， 需要考虑不同引物和探 针间的干扰和匹配性， 各引物和探针的比例需要不断优化， 并不是简单随意的配比， 为达到 最佳扩增效果， 还需要对扩增反应的退火温度和反应条件不断优化， 确定最佳的引物探针 配比和反应条件。 因此， 在荧光PCR方法在建立过程中需要优化各种条件。 选择不同厂家试 剂进行比对分析， 选择性价比高， 检测效果好的试剂， 一种优质检测方法的研制并非想的那 么简单， 需要大量的时间和精力付出， 不断调试验证。 [0005]猪病毒性腹泻是猪最重要的一类疾病， 可造成仔猪大批量死亡， 猪场损失严重， PEV和PTV均是导致猪腹泻的重要病原， 均能通过粪口途径传播。 此外， PEV和PTV还均能引起 猪神经症状、 繁殖障碍等， 临床上症状表现类似， 很难区分， 需要通过实验室方法进 行鉴别。 当前存在分别针对PEV或PTV单项荧光PCR方法， 但没有同时检测PEV和PTV荧双重光PCR方 法， 且操作繁琐， 对实验室条件要求高， 存在气溶胶污染风险。 对PEV和PTV同时快速检测是 猪场亟需的技 术， 需要研制适 合现场快速检测、 高效、 灵敏、 简便的试剂盒。 发明内容 [0006]有鉴于此， 本 发明的目的之一在于提供一种用于同时检测PEV和PTV的直接扩增荧说　明　书 1/7 页 3 CN 114574632 A 3