(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210213993.5 (22)申请日 2022.03.07 (71)申请人 南京鼓楼医院 地址 210008 江苏省南京市 鼓楼区中山路 321号 (72)发明人 段红蕾　李洁　李志民　韩乃坚　 姜子晗　 (74)专利代理 机构 南京钟山专利代理有限公司 32252 专利代理师 张明浩 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种基于高通量测序的RhD基因型检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于高通量测序的RhD基 因型检测方法， 其中： 提取外周血游离DNA样本, 利用2对保守性引物同时从外周血游离DNA中扩 增出RhD基因和 RHCE基因第9外显子及上下游基 因盒,进行高通量测序,区分RhD基因全缺失型、 RhD基因部分转换型、 RhD突变型以及RhD野生型 四种基因型。 本发明可以一次性同时有效区分 RhD基因全 缺失型 （RHD*01N.01） 、 RhD基因部分转 换型 （RHD*01N.03） 、 RhD1227A突变型 （RHD* 01EL.01） 以及RhD野生型 （RHD*01） 四种基因型， 为RhD基因型检测提供了一种全新的方法。 权利要求书2页 说明书3页 CN 114457169 A 2022.05.10 CN 114457169 A 1.一种基于高通量测序的RhD基因型检测方法， 其特征是： 提取外周血游离DNA样本,利 用2对保守性引物同时从外周血游离DNA 中扩增出RhD基因和RHCE基因第9外显子及上下游 基因盒,进行高通量测序,区分RhD基因全缺失型 （RHD*01N.01） 、 RhD基因部分转换型 （RHD* 01N.03） 、 RhD1227A突变型 （RHD*01EL.01） 以及RhD野生型 （RHD*01） 四种基因型， 引物序列如 下： Exon9F 5' TCACGTTAATAGGTGAAAAATCTTAC 3'， Exon9R 5' TGCATTTAAACAGGTTTGCTC 3'， BoxF 5' GTGGCTGGCTTTTGCTATTTC 3'， BoxR 5' ATACATGCT TAATTTGTCATTC 3'。 2.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序的RhD基因型检测方法， 其特征是： 引物 序列基于NC_0 00001.11 （GRCh38） 为模板设计引物， 扩增产物分别为1 13bp和10 3bp， 扩增体系为25 µL， 包括： 1U/µl KAPAHiFi  DNA Polymerase， 0.5 µl； DNA模板， 0.5 µl； 10µM 正向和反向引物， 各0.75 µl； 10mM dNTP Mix， 包含dATP、 dCTP和dGTP， 0.75 µl； 5x KAPAHiFi  Fidelity buffer， 含MgCl2， 5µl； 25mM KAPA MgCl2 2µl； 1U/µl Uracil‑DNA Glycosylase  1µl； 20mM dUTP 0.75µl； 灭菌去离 子水 11.5µl； PCR反应条件为： 25℃， 10mi n； 95℃ 2min； 98℃ 15s， 60℃ 5min， 25个循环。 3.根据权利要求2所述的一种基于高通量测序的RhD基因型检测方法， 其特征是： 扩增 后的片段添加接头和index构建扩增子文库， 使用Nextseq  550AR仪器及配套NextSeq  500/ 550高通量v2试剂盒进行高通 量测序。 4.根据权利要求3所述的一种基于高通量测序的RhD基因型检测方法， 其特征是： 高通 量测序数据的前处 理： 使用cutadapter的工具去除测序接 头和低质量的reads。 5.根据权利要求3所述的一种基于高通量测序的RhD基因型检测方法， 其特征是： 利用 前处理后的高通量测序数据， 通过bwa工具与人类基因组hg19进 行比对， 计算相应靶点的测 序深度 （D_i） ， 通过变异检测工具varscan， 对靶点所获得的基因型 （G_i） 以及匹配到野生型 （Ref_i） 和突变型 （Alt_i） 模版的reads数量分别进行统计， 以匹配到RhD基因盒上的reads 的平均数计算基因 组正常拷贝数测序深度的基线 （D_n orm） ， 对于缺失型位点， 当  D_norm * 2%<D_i<D_nor m * 3%时， 认为样本为RhD基 因全缺失型 （RHD*01N.01） 或RhD基因部分转换型 （RHD*01N.03） 的纯合状态； 当D_i>D_norm  * 3%时， 认 为样本为RhD基因全缺失型 （RHD*01N.01） 或RhD基因部分转换型 （RHD*01N.03） 与RhD 野生型 （RHD*01） 的杂合状态； 当D_i<D_n orm * 2%时， 认为样本为RhD野生型 （RHD* 01） 纯合状态， 对于突变型位点， 当  Alt_i>D_norm  * 3%时， 认为样本为RhD突变型 （RHD*01EL.01） 纯 合状态； 当D_norm  * 2%<Alt_i<D_norm  * 3%， 认为样本为RhD突变型 （RHD*01EL.01） 与RhD 野生型 （RHD*01） 的杂合状态； 当Alt_i<D_norm  * 2% ， 认为样本为RhD 野生型 （RHD*01） 纯合权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114457169 A 2状态。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114457169 A 3