(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210209958.6 (22)申请日 2022.03.04 (71)申请人 北京市食品安全监控和风险评估中 心 （北京市食品检验所） 地址 100094 北京市海淀区永丰产业基地 丰德东路十七号 (72)发明人 李恩静　王丹　薛晨玉　杨红莲　 耿健强　穆同娜　吴燕涛　何湘漪　 郭淼　胡智恺　 (74)专利代理 机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 专利代理师 孙怡 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01)C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 1/06(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种检测乳粉中双歧杆菌的微滴数字PCR方 法及应用 (57)摘要 本发明涉及检测技术领域， 具体公开了一种 检测乳粉中双歧杆菌的微滴数字PCR方法及应 用。 本发明的检测乳粉中双歧杆菌的微滴数字 PCR方法， 包括待测品的前处理步骤， 所述前处理 步骤包括： (1)对所述待测品的溶液进行离心， 去 上清； (2)进行冷热交替处理； (3)以蛋白酶K进行 消化； (4)以溶菌酶进行消化； (5)以蛋白酶K和缓 冲液GA进行消化。 本发明的检测方法， 速度快、 特 异性好、 准确度高， 适用于乳粉产品的双歧杆菌 的定量检测工作。 权利要求书1页 说明书11页 序列表2页 附图3页 CN 114457175 A 2022.05.10 CN 114457175 A 1.一种检测乳粉中双歧杆菌的微滴数字PCR方法， 其特征在于， 包括待测品的前处理步 骤， 所述前处 理步骤包括： (1)对所述待测品的溶 液进行离心， 去上清； (2)进行冷热交替处 理； (3)以蛋白酶K进行消化； (4)以溶菌酶进行消化； (5)以蛋白酶K和缓冲液GA进行消化。 2.根据权利要求1所述的微滴数字PCR方法， 其特征在于， 步骤(2)具体为： ‑18℃～‑20 ℃， 处理1.5～2min后， 100℃处理0.9～1.1min， 反复多次。 3.根据权利要求1或2所述的微滴数字PCR方法， 其特征在于， 步骤(5)中消化的条件为 55～57℃， 1.2 ～1.5h。 4.根据权利 要求1‑3任一项述的微滴数字PCR方法， 其特征在于， 步骤(1)具体包括两次 离心， 第一次离心为： 以11,000～12,000rpm， 离心10～12min； 第二次离心为： 将所述第一次 离心获得的沉淀与PBS混合， 以1 1,000～12,000rpm， 离心10～12mi n。 5.根据权利要求1 ‑4任一项所述的微滴数字PCR方法， 其特征在于， 步骤(3)中， 所述蛋 白酶K与所述待测品的质量比为(0.015～0.3 0)： 1； 和/或， 步骤(5)中， 所述蛋白酶K与所述缓冲液GA的质量比为1： (0.1～0.2)。 6.根据权利 要求1‑5任一项所述的微滴数字PCR方法， 其特征在于， 所述微滴数字PCR方 法所用的引物、 探针如SEQ  ID No.1‑3所示。 7.根据权利 要求1‑6任一项所述的微滴数字PCR方法， 其特征在于， 所述微滴数字PCR方 法的反应体系， 每20μL包括： 2 ×探针法ddPCR预混液10μL， 终浓度均为500nM的上、 下游引 物， 终浓度为25 0nM的探针， 模板2 μL， 余 量为灭菌双蒸水。 8.根据权利 要求1‑7任一项所述的微滴数字PCR方法， 其特征在于， 所述微滴数字PCR方 法的反应程序为： 95℃10mi n； 94℃30s， 58℃3 0s， 72℃3 0s， 进行43个 循环； 98℃10mi n。 9.一种权利要求1 ‑8任一项所述的微 滴数字PCR方法在乳粉质量控制中的应用。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特 征在于， 所述乳粉为 婴幼儿配方乳粉。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114457175 A 2一种检测乳粉 中双歧杆菌的微滴数字PCR方 法及应用 技术领域 [0001]本发明涉及检测技术领域， 具体地说， 涉及一种检测乳粉中双歧杆菌 的微滴数字 PCR方法及应用。 背景技术 [0002]婴幼儿配方乳粉是以乳类及乳蛋白制品为主要蛋白来源， 加入适量的维生素、 矿 物质和(或)其他辅料， 采用物理方法生产加工制成的产品， 其能量和营养成分能够部分满 足初生至3周 岁婴幼儿的成长需要， 根据不同年龄段婴幼儿营养的需求， 主要分为婴儿配方 乳粉和较大婴儿及幼儿配方乳粉。 [0003]婴幼儿配方乳粉中添加了一定量的益生菌， 可以维持 “免疫不全期 ”婴幼儿肠道的 菌群平衡， 保持益生菌的优势地位， 改善婴幼儿的免疫系统， 促进肠胃消化吸收， 有效促进 婴幼儿正常生长发育。 由于婴幼儿各项身体机能尚未健全， 营养学界普遍认为， 为婴幼儿补 充的益生菌只允许添加非致病性的产L(+) ‑乳酸的益生菌， 主要以双歧杆菌为主， 也包括乳 杆菌的某些特定菌株。 为了规范菌株使用， 目前一般可应用于婴幼儿食品的益生菌共13株 11个菌种， 主要以双歧杆菌和乳杆菌为主。 如， 动物双歧杆菌Bb ‑12、 乳双歧杆菌HN019、 Bi ‑ 07和嗜酸乳杆菌NCFM 。 [0004]婴幼儿配方乳粉中添加益生菌种类的规范保证了其安全性， 而益生菌产品的活菌 数是保证其功能特性 的关键因素， 一般在其保质期内活菌数目应不得少于106CFU/g。 针对 益生菌定量检测的现行有效方法是平板计数法， 该方法在实际应用中存在耗时长(一般为 72h)、 工作量大和操作较繁琐等缺陷。 近年来， 以实时荧光定量PCR(Real ‑time  quantitative  PCR， qPCR)为代表的分子生物学技术也逐渐被广泛应用到益生菌的定量检 测工作中。 相比较于传 统培养法， qPCR快速、 灵敏、 特异， 但该方法属 于相对定量， 结果的准 确性和重复性在很大程度上依赖于所绘制的标准曲线质量及扩增效率， 并且需要 具备已知 浓度的核酸标准品。 新兴的微滴式数字PCR(Droplet  Digital PCR， ddPCR)被认为是第三代 核酸扩增技术， 通过把稀释 到一定浓度的DNA分子分布到10000～20000个微滴中， 使大部 分 微滴中DNA分子的数量为1或0， 然后通过PCR扩增和阳性信号的累积来读取阳性反应单元 数， 采集阳性信号与阴性信号的比例， 再根据泊松分布计算出样本中的DNA分子数， 从而实 现对DNA分子的绝对定量。 [0005]目前该技术在在食品领域的应用日益增多， 主要应用于食原性致病菌检测、 转基 因植物检测、 动物源性成分检测等方面。 还 未有ddPCR技术应用于婴幼儿配方食品中益生菌 检测的文献报道， 针对现有检测方法的不 足， 本发明拟采用ddPCR检测技术建立针对婴幼儿 食品中常见益生菌的快速准确定量方法， 为制订婴幼儿食品中益生菌定量检测标准提供思 路和技术支持。 发明内容 [0006]针对现有技术的问题， 本发明的目的是提供一种快速、 灵敏、 准确的乳粉中双歧杆说　明　书 1/11 页 3 CN 114457175 A 3