(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210075292.X (22)申请日 2022.01.22 (71)申请人 北京新基永康生物科技有限公司 地址 102600 北京市大兴区北京经济技 术 开发区科创十四街99号2幢201室、 402 室 (72)发明人 韩晶　韩敏　任鹏飞　王俊峰　 王玉朗　 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种检测幽门螺旋杆菌23SrRNA 基因突变的 引物和探 针组合物及其应用、 试剂盒 (57)摘要 本申请涉及生物检测技术领域， 具体公开了 一种检测幽门螺旋杆菌23S  rRNA基因突变的引 物和探针组合物及其应用、 试剂盒。 所述引物和 探针组合物包括用于检测幽门螺杆菌23S  rRNA 基因的A2142C位点、 A2142G位点和A2143G位点的 突变型引物和探针组合物、 用于检测幽门螺杆菌 16S rRNA基因的引物和探针组合物、 用于检测人 源RNAse P基因的引物和和探针组合物、 以及封 阻引物。 所述引物和探针组合物在制备用于检测 幽门螺旋杆菌23S  rRNA基因突变的试剂或试剂 盒的应用。 所述试剂盒包括上述引物和探针组合 物。 本申请提高幽门螺旋 杆菌23S rRNA基因突变 的检测效率。 权利要求书2页 说明书8页 序列表3页 附图2页 CN 114574601 A 2022.06.03 CN 114574601 A 1.一种检测幽门螺旋杆菌23S  rRNA基因突变的引物和探针组合物， 其特征在于， 所述 引物和探针组合物包括用于检测幽门螺杆菌23S  rRNA基因的A2142C位点、 A2142G位点和 A2143G位点的突变型引物和探针组合物、 用于检测幽门螺杆菌16S  rRNA基因的引物和探针 组合物、 用于检测人源RNAse  P基因的引物和 和探针组合物、 以及封阻引物； 所述突变型引物和探针组合物包括： 23S‑A2142G正向突变型引物： 5' ‑GTAAAGGTCCACGGGGTCTTC‑3' 23S‑A2142C正向突变型引物： 5' ‑TAAAGGTCCACGGGGTCTTG‑3' 23S‑A2143G正向突变型引物： 5' ‑AGTAAAGGTCCACGGGGTCTC‑3' 23S‑A21反向突变型引物： 5' ‑AGAGATTCAGTGAAATTGTAGTGGAG‑3' 23S‑A21突变型探针： 5' ‑AAAATTCCTCCTACCCGCGGCAA‑3' 所述23S‑A21突变型探针的5'端标记荧 光报告基团、 3'端标记荧 光淬灭基团； 所述16S rRNA基因的引物和探针组合物包括： 16S正向引物： 5' ‑CAGCCATGTTGCGGTGAA‑3' 16S反向引物： 5' ‑AAACACAACTCCCATGGTGTGA‑3' 16S探针： 5' ‑ACGTTCCCGGGTCTTGTACTCAC CG‑3' 所述16S探针的5'端标记荧 光报告基团、 3'端标记荧 光淬灭基团； 所述人源RNAse  P基因的引物和探针组合物包括： RNP正向引物： 5' ‑AGATTTGGACCTGCGAGCG ‑3' RNP反向引物： 5' ‑GAGCGGCTGTCTC CACAAGT‑3' RNP探针： 5' ‑TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG ‑3' 所述RNP探针的5'端标记荧 光报告基团、 3'端标记荧 光淬灭基团； 所述封阻引物包括： 23S Blocker引物： 5' ‑CCACGGGGTCTTTC‑3' 所述23S Blocker引物的3'端标记MGB； 所述23S‑A21突变型探针、 所述16S探针和所述RNP探针 的5'端标记荧光报告基团各不 相同。 2.根据权利要求1所述的引物和探针组合物， 其特征在于， 所述23S ‑A21突变型探针的 5'端标记荧 光报告基团FAM、 3'端标记荧 光淬灭基团BHQ1。 3.根据权利要求1所述的引物和探针组合物， 其特征在于， 所述16S探针的5'端标记荧 光报告基团VIC、 3'端标记荧 光淬灭基团BHQ1。 4.根据权利要求1所述的引物和探针组合物， 其特征在于， 所述内参基因探针的5'端标 记荧光报告基团C Y5、 3'端标记荧 光淬灭基团BHQ1。 5.如权利要求1至4中任意一项所述的引物和探针组合物在制备用于检测幽门螺旋杆 菌23SrRNA基因突变的试剂或试剂盒的应用。 6.一种检测幽门螺旋杆菌23S  rRNA基因突变的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括 如权利要求1至4中任意 一项所述引物和探针组合物。 7.根据权利要求6所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括尿嘧啶 ‑N‑糖基化酶、 缓冲液、 dNTPs、 DNA聚合酶。 8.根据权利要求6或7所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒的使用方法包括如下步权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114574601 A 2骤： (1)提取待测样本DNA； (2)单管多重荧 光定量PCR反应： 以样本DNA为模板， 利用如权利要求1至4中任意一项所述引物和探针组合物进行单管 多重荧光定量PCR反应， 得到实时荧 光定量PCR扩增曲线； (3)根据实时荧 光定量PCR扩增曲线判断突变情况。 9.根据权利要求8所述的试剂盒， 其特 征在于， 所述 突变情况的判断方法为： ①若待测样本的FAM荧光通道有明显扩增信号、 或者FAM荧光通道的CtFAM值>37时， 则为 突变阴性； ②若待测样本的FAM荧光通道有明显扩增信号且FAM荧光通道的CtFAM值≤37时， 则计算 FAM荧光通道CtFAM值与HEX(VIC)荧光通道CtHEX(VIC)值的差值ΔCt， 即ΔCt＝CtFAM值‑ CtHEX(VIC)值； 若ΔCt≥9， 则为 突变阴性； 若ΔCt<9， 则为 突变阳性。 10.根据权利要求8所述的试剂盒， 其特征在于， 所述单管多重荧光定量PCR反应的扩增 程序为： 37℃酶反应5min， 进行1个循环； 95℃预变性5min， 进行1个循环； 95℃变性15s， 60℃ 退火与延伸40s， 进行45个 循环。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114574601 A 3