(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210070486.0 (22)申请日 2022.01.21 (71)申请人 江西省检验检测认证总院食品检验 检测研究院 地址 330000 江西省南昌市南昌县小蓝经 济技术开发区金沙二路189 9号 (72)发明人 范宏伟　吴鑫　章志超　占忠旭　 朱应飞　翟平平　 (74)专利代理 机构 南昌大牛知识产权代理事务 所(普通合伙) 36135 代理人 刘俊文 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/42(2006.01) C12R 1/445(2006.01) C12R 1/63(2006.01) C12R 1/01(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 五种食源性致病菌的多重PCR检测引物组、 试剂盒和方法 (57)摘要 本发明公开了五种食源性致病菌的多重PCR 检测引物组、 试剂盒和方法。 该引物组由检测沙 门氏菌、 金黄色葡萄球菌、 副溶血性弧菌、 单核细 胞增生李斯特氏菌和大肠埃希氏菌O15 7： H7的引 物对组成； 该方法以上述的引物组作为引物， 以 待测样本的基因组DNA为模板DNA进行 五重PCR扩 增， 当PCR扩增条带中同时出现335bp、 274bp、 261bp、 291bp和302bp五个 特异性片段， 则判定待 测样本中同时含有上述五种食源性致病菌。 本发 明提供的引物组能够同时对上述五种食源性致 病菌进行检测， 基于该引物组建立的多重PCR检 测方法具有良好的特异性和敏感性， 检出限达到 了5×10‑3ng/μL。 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 附图3页 CN 114381536 A 2022.04.22 CN 114381536 A 1.一种多重PCR检测食源性致病菌的引物组， 其特征在于， 由检测沙门氏菌、 金黄色葡 萄球菌、 副溶 血性弧菌、 单核细胞增生李斯特氏菌和大肠埃希氏菌O157： H7的引物对组成； 所述检测沙门氏菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ  ID NO： 1和SEQ  ID  NO： 2所示； 所述检测金黄色葡萄球菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由S EQ ID NO： 3和SEQ ID NO： 4所示； 所述检测副溶血性弧菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由 SEQ ID NO： 5和SEQ  ID NO： 6所示； 所述检测单核细胞增生李斯特氏菌引物对的上下游引物 的核苷酸序列分别由SEQ  ID NO： 7和SEQ  ID NO： 8所示； 所述检测大肠埃希氏菌O157： H7引 物对的上 下游引物的核苷酸序列分别由SEQ  ID NO： 9和SEQ  ID NO： 10所示。 2.一种检测食 源性致病菌的试剂盒， 其特 征在于， 包括权利要求1所述的引物组。 3.一种检测食源性致病菌的方法， 其特征在于， 以权利要求1所述的引物组作为引物， 以待测样本的基因组DNA为模板DNA进行五重PCR扩增， 当PCR扩增条带中同时出现335bp、 274bp、 261bp、 291bp和302bp 五个特异性片段， 则判 定待测样本中同时含有沙门氏菌、 金黄 色葡萄球菌、 副溶 血性弧菌、 单核细胞增生李斯特氏菌和大肠埃希氏菌O157:H7。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述五重PCR扩增体系以25μL计， 包括： 10 种引物的终浓度均为0.2 μmo l， PCRmix 12.5 μL， 模板DNA  1 μL， 蒸馏水补足至25 μL。 5.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述五重PCR扩增的程序包括： 94℃变性 30s， 56℃退火45s， 72℃延伸45s， 3 5个循环； 72℃延伸10mi n。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114381536 A 2五种食源性致病菌的多重PCR检测引物组、 试剂盒和方 法 技术领域 [0001]本发明属于微生物检测领域， 具体涉及五种食源性致病菌的多重PCR检测引物组、 试剂盒和方法。 背景技术 [0002]沙门氏菌(Salmonella)是一种常见的食源性致病菌， 主要是通过污 染的食物和水 源摄入。 本菌广泛分布于自然界， 引起人类和 动物的许多临床和亚临床感染症状， 因此具有 重要的公共卫 生意义， 是目前世界各国分离率 最高的菌型之一。 [0003]金黄色葡萄球菌(Staphylococcus  aureus)是一种常见的食源性致病微生物， 其 繁殖过程中产生的肠毒素是引发食物中毒的致病因子。 近几年， 金黄色葡萄球菌引发的食 物中毒报道层出不穷， 由金黄 色葡萄球菌引起的食物中毒占食源性微生物食物中毒事件的 25％左右， 金黄色葡萄球菌成为仅次于 沙门氏菌和副溶 血杆菌的第三大微 生物致病菌 。 [0004]副溶血性弧菌(Vibrio  parahaemolyticus)是一种重要的食源性致病菌。 该菌存 活能力强， 在抹布和砧板上能生存1个月以上， 海 水中可存活47天。 常存在于近海岸海 水、 海 产品及盐渍食品中。 它是我国沿海地区最常见的食物中毒病原菌。 由于海鲜空运， 内地城市 病例也渐增多。 人们食用被副溶血性弧菌污染的食物后极可能会引起以腹痛、 腹泻、 恶心、 呕吐、 发热等 为主要症状的急性肠胃炎 。 [0005]单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria  monocytogenes)是一种人畜共患病的病原 菌。 它生命力顽强， 在0℃～ 45℃都能生存， 在 冰箱的冷藏 温度下仍可生长， 这也是它不同于 其他食源性致病菌的重要特征。 该菌主要以食物为传染媒介， 是最致命的食源性病原体之 一， 造成二至三成的感染者死 亡， 其致死率甚至高过沙门氏菌及肉毒杆菌 。 [0006]大肠埃希氏菌O157:H7是肠出血性大肠杆菌(EHEC)的一个血清型， 是引起食源性 疾病主要血清型， 主要临床症状为突发性腹痛、 腹泻、 血便， 严重时并发肾衰竭， 病死率高。 大肠杆菌 O157:H7主要污染肉类食品， 蔬菜中也时有检出， 是食品中潜在危害巨大的食源性 致病菌。 [0007]因此， 快速、 特性、 高效的检出食品中的上述致病菌， 对于其引起的食源性疾病防 控以及暴露病例的治疗具有重要的意义。 目前食品中食源性致病菌的检测主要依靠传统的 细菌分离鉴定和细菌16S  rRNA的单一PCR扩增及产物测序比对， 存在操作繁琐、 检测周期 长、 灵敏度低等问题。 因此， 建立一种能同时鉴别食品中多种食源性致病菌的多重PCR (Multiplex polymerase chain reaction， MPCR)方法是目前的重点研究方向， 其不仅具有 普通PCR的高特异性和敏感性等优点， 还能同时扩增多个基因片段， 快速准确， 可用于多种 病原的鉴定或同种病原多个基因的检测。 目前对这五种致病菌中的一种、 数种的单重、 多重 PCR方法均有报导， 但同时检测这五种 病原的检测方法还未 见报导。 发明内容 [0008]有鉴于此， 本 发明的目的在于提供一种同时检测沙门氏菌、 金黄色葡萄球菌、 副溶说　明　书 1/4 页 3 CN 114381536 A 3