(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210072000.7 (22)申请日 2022.01.21 (71)申请人 南京邮电大 学 地址 210009 江苏省南京市 鼓楼区新模范 马路66号 (72)发明人 宋春元　汪联辉　张晶晶　 (74)专利代理 机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 代理人 曹翠珍 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6837(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于检测肿瘤微小核酸标志物的表面增强 拉曼散射检测试剂盒及其制备方法与应用 (57)摘要 本发明公开了一种用于非疾病诊断目的的 肿瘤微小核酸标志物检测的表面增强拉曼散射 检测试剂盒及其制备方法与应用。 该试剂盒包括 SERS检测芯片， 第一、 二试剂。 SERS检测芯片为表 面修饰有发夹型DNA单链H1的银纳米棒阵列基 片， 第一试剂为发夹型DNA单链H2， 第二试剂为 SERS探针， 在SERS检测芯片上同时加入第一、 二 试剂后， 第二试剂上的探针 单链P与H1 ‑H2双链的 粘性末端杂交， 将SERS探针捕获至SERS检测芯片 上 （核酸探针的碱基序列可调） ， 通过测试SERS检 测芯片上SERS探针的拉曼信号， 实现对于胃癌微 小核酸标志物的检测， 并且可实现在血清等复杂 环境中多种核酸生物标志物的一体化检测， 有效 提升检测的特异性与准确性。 权利要求书2页 说明书9页 序列表3页 附图3页 CN 114410786 A 2022.04.29 CN 114410786 A 1.用于非疾病 诊断目的的肿瘤微小核酸标志物检测的表面增强拉曼散射检测试剂盒， 其特征在于， 所述SERS检测试剂盒包 含SERS检测芯片、 第一试剂和第二试剂； 所述SERS检测芯片为表面 修饰有发夹型DNA单链H1的银纳米棒阵列基片； 所述第一试剂为发夹型DNA单链H2， 所述第二试剂为配合基片使用的SERS探针； 所述SERS探针为表面修饰探针单链P和拉曼分子5,5' ‑二硫代双(2 ‑硝基苯甲酸) (DTNB)的金纳米颗粒。 2.根据权利要求1所述的用于非疾病 诊断目的的肿瘤微小核酸标志物检测的表面增强 拉曼散射检测试剂盒， 其特 征在于： 以检测胃癌微小 核酸标志 物miRNA‑378为例， 所述发夹型DNA单链H1碱基序列如SEQ  ID NO： 2所示： H1： 5’ ‑SH‑(CH2)6‑TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TCC TTC TGA CTC CAA  GTC CAG TCA GAA GGA ACT AGC ACT GGA CTT GGA GT‑3’ 所述发夹型DNA单链H2的碱基序列如SEQ  ID NO： 3所示： H2： 5’ ‑GTC CAG TGC TAG TTC CTT CTG ACT GGA CTT GGA CAC AGA AGG AAC TAG CCG  ACT CAA GAG CAC‑3’ 所述探针单链P的碱基序列如SEQ  ID NO： 4所示： P： 5’ ‑SH‑(CH2)6‑TTT TTT TTT GTG CTC TTG AGT CG‑3’。 3.根据权利要求2所述的用于非疾病 诊断目的的肿瘤微小核酸标志物检测的表面增强 拉曼散射检测试剂盒， 其特 征在于： 调整H1、 H2和P的碱基序列为H1 ‑199a、 H2‑199a和P‑199a， 所得试剂盒用于检测胃癌微 小核酸标志 物miRNA‑199a‑3p； 调整H1、 H2和P的碱基序列为H1 ‑100、 H2‑100和P‑100， 所得试剂盒用于检测胃癌微小核 酸标志物miRNA‑100。 4.根据权利要求1所述的用于非疾病 诊断目的的肿瘤微小核酸标志物检测的表面增强 拉曼散射检测试剂盒， 其特征在于， 所述银纳米棒阵列采用真空电子束蒸发镀膜技术制备； 所述金纳米颗粒 粒径为15～10 0nm。 5.权利要求1所述的用于非疾病诊断目的的肿瘤微小核酸标志物检测的表面增强拉曼 散射检测试剂盒， 其特征在于， 所述发夹型DNA单链H1的浓度为0.5～2 μM， 所述第一试剂的 浓度为5～ 20 μM。 6.权利要求2任一项所述的用于非疾病诊断目的的肿瘤微小核酸标志物检测的表面增 强拉曼散射检测试剂盒的制备 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (一)SERS检测芯片制备： (1)制备银纳米棒阵列并用超纯 水多次冲洗； (2)将发夹型DNA单链H1退火处理后取发夹型DNA单链H1与TCEP溶液以摩尔比1： 100到 1： 1000混合置于25℃恒温混匀仪中反应， 所述的退火处理是加热95℃放置5～10分钟后于 冰水浴中降温至25℃； (3)将银纳米棒阵列和20μL  500nM发夹型DNA单链H1溶液共培养， 发夹型DNA单链H1通 过巯基与银形成共价键而固定在银纳米棒阵列表 面； 培养条件： 25～37℃， 60～8 0％湿度环 境中静置 3～5小时；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114410786 A 2(4)使用反应缓冲液清洗基片后， 将20 μL  1mM 6‑巯基己醇滴加至上述基片表面置于25 ℃恒温混匀仪中反应10分钟； (5)依次用反应缓冲液和超纯 水多次清洗基片， 得到SERS检测芯片； (二)、 第一试剂： 根据发夹型DNA单链H1设计并合成的发夹型DNA单链H2即为第一试剂； (三)第二试剂即SERS探针的制备： (1)将探针单链P与TCEP溶液以摩尔比1： 100到1： 1000混合置于25℃恒温混匀仪中反 应； (2)将10 μL  50 μM探针单链P与500 μL  2.3nM AuNP溶液混合于0.5 ×TBE溶液中， 并于25 ℃温度下3 00rpm培养过夜； (3)每隔30分钟分4次缓慢加入5、 10、 15和20 μL的2M  NaCl溶液形成混合物， NaCl的最终 浓度为20 0mM， 在25℃3 00rpm的条件下共培 养过夜； (4)加入10 μL  100 μM的拉曼分子DTNB反应3小时； (5)最后通过离心去除上清液， 用0.5 ×TBE溶液分散离心沉积物并定容至75 μL， 即得到 第二试剂。 7.权利要求6所述的用于非疾病诊断目的的肿瘤微小核酸标志物检测的表面增强拉曼 散射检测试剂盒的制备 方法， 其特 征在于： 将4‑MBA添加到探针单链P ‑199a功能化的AuNP溶液中， 即可制备用于miRNA ‑199a‑3p检 测的SERS探针； 将2‑MBT添加到探针单链P ‑100功能化的AuNP溶液中， 即可制备用于miRNA ‑100检测的 SERS探针。 8.权利要求2所述的用于非疾病诊断目的的肿瘤微小核酸标志物检测的表面增强拉曼 散射检测试剂盒的应用， 其特 征在于， 步骤如下： 1)将第一试剂、 第二试剂和含有不同浓度的目标肿瘤微小核酸标志物的样品溶液混 合， 滴加至SERS检测芯片表面共培 养； 2)用超纯水清洗芯片多次后进行SERS测试， 得到不同浓度目标肿瘤微小核酸标志物对 应的SERS光谱及其特征信号强度值， 以目标肿瘤微小核酸标志物浓度的对数为横坐标， 以 SERS特征峰强度值为纵坐标， 得到SERS检测试剂盒的工作曲线， 根据工作曲线计算SERS检 测试剂盒检测肿瘤微小 核酸标志 物的检测限； 3)将待检测样品与第一试剂、 第二试剂混合后滴加至SERS检测芯片表面共培养， 用超 纯水清洗芯片多 次后进行SERS测试， 得到SERS光谱及其特征信号强度值， 根据工作曲线计 算得到待检测样品中目标肿瘤微小 核酸标志 物的浓度。 9.根据权利要求6所述的用于非疾病 诊断目的的肿瘤微小核酸标志物检测的表面增强 拉曼散射检测试剂盒的制备方法， 其特征在于， 所述步骤1)和 3)中共培养条件为在25～37 ℃， 300rpm的恒温混匀仪中培 养50分钟。 10.根据权利要求8所述的用于非疾病诊断目的的肿瘤微小核酸标志物检测的表面增 强拉曼散射检测试剂盒的应用， 其特征在于， 所述的目标肿 瘤微小核酸标志物miRNA ‑378、 miRNA‑199a‑3p或者miRNA ‑100。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114410786 A 3