(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210054808.2 (22)申请日 2022.01.18 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114058742 A (43)申请公布日 2022.02.18 (73)专利权人 广州科方生物技 术股份有限公司 地址 510000 广东省广州市高新 技术产业 开发区科学城开源大道11号C4栋五 层、 六层 (72)发明人 李娇娇　 (74)专利代理 机构 广州市越秀区哲力专利商标 事务所(普通 合伙) 44288 代理人 李晓阳 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (56)对比文件 CN 107058622 A,2017.08.18 CN 107937613 A,2018.04.20 CN 112458212 A,2021.0 3.09 CN 110468234 A,2019.1 1.19 CN 1018125 32 A,2010.08.25 CN 109628641 A,2019.04.16CN 111910017 A,2020.1 1.10 US 201410 6990 A1,2014.04.17 CN 105400907 A,2016.0 3.16 CN 106645681 A,2017.0 5.10 Yu Chen等.“Simultaneous Detecti on of Influenza A, I nfluenza B, and Respiratory Syncytial Viruses and Subtypi ng of Influenza A H 3N2 Virus and H1N1 (20 09) Virus by Multiplex Real-Time PCR ”. 《JOURNAL OF CL INICAL MICROBIOLO GY》 .2011, 第46卷(第4期), 陈勇等.“五种主要上呼吸道病毒 多重RT- PCR检测方法的建立 ”. 《现代生物医学进 展》 .2012,第12卷(第7期), 王玉月等. “多重实时荧 光定量PCR对9种常 见呼吸道病原体 检测”. 《标记免疫分析与临床》 .2015,第2 2卷(第11期), Pamela O sterlund等. “Incoming Influenza A Virus Evades Early Host Recognition, while Influenza B Virus Induces I nterfero n Expres sion Directly upon Entry”. 《Journal of Viro logy》 .2012,第 86卷(第20期), 审查员 夏士博 (54)发明名称 一种引物探针组合物、 包含其的试剂盒及其 检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种引物探针组合物、 包含其 的试剂盒及其检测方法， 属于病毒检测技术领 域， 本发明提供的引物探针组合包括针对甲型流 感病毒、 乙型流感病毒及呼吸道 合胞病毒的特异 性引物和探针， 该特异性引物和探针具有良好的 特异性， 采用本发明的试剂盒， Q ‑PCR的方法可以 实现对甲型流感病毒、 乙型流 感病毒及呼吸道合 胞病毒的高特异性、 高灵敏度、 高效率的检测。 权利要求书2页 说明书14页 序列表3页 附图4页 CN 114058742 B 2022.04.22 CN 114058742 B 1.一种引物探针组合物， 其特 征在于， 包括以下组分： 甲型流感病毒的上游引物， 其核酸序列如SEQ  ID NO:1所示； 甲型流感病毒的下游引物， 其核酸序列如SEQ  ID NO:2所示； 甲型流感病毒的探针， 其核酸序列如SEQ  ID NO:3所示； 乙型流感病毒的上游引物， 其核酸序列如SEQ  ID NO:4所示； 乙型流感病毒的下游引物， 其核酸序列如SEQ  ID NO:5所示； 乙型流感病毒的探针， 其核酸序列如SEQ  ID NO:6所示； 呼吸道合胞病毒的上游引物， 其核酸序列如SEQ  ID NO:7所示； 呼吸道合胞病毒的下游引物， 其核酸序列如SEQ  ID NO:8所示； 呼吸道合胞病毒的探针， 其核酸序列如SEQ  ID NO:9所示。 2.根据权利要求1所述的一种引物探针组合物， 其特征在于， 所述SEQ  ID NO:3所示探 针的5’端标记VIC荧光基团， 3 ’端标记BHQ1淬灭基团； 所述SEQ ID NO:6所示探针的5 ’端标记ROX荧光基团， 3 ’端标记BHQ2淬灭基团； 所述SEQ   ID NO:9所示探针的5 ’端标记FAM荧 光基团， 3 ’端标记BHQ1淬灭基团。 3.一种检测甲型流感病毒、 乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒核酸联合检测试剂盒， 其 特征在于， 所述试剂盒包括含有权利要求1或2所述的引物探针组合物的PCR反应液。 4.根据权利要求3所述的试剂盒， 其特征在于， 所述PCR反应液还包括PCR缓冲液、 dNTPs、 DNA聚合酶和反转录酶。 5.根据权利要求3所述的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒还包括阳性质控 品和阴性质 控品， 所述阳性质控品为灭活的甲型流感病毒、 乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒基因片段 的混合物， 所述阴性质控品为灭活的内标基因片段， 所述灭活的内标基因片段为人核糖核 酸酶P的基因片段。 6.根据权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于， 所述反应液还包括所述人核糖核酸酶P 的基因片段的上游引物、 下游引物和探针， 所述上游引物的核酸序列如S EQ ID NO:10所示， 所述下游引物的核酸序列如SEQ  ID NO:11所示， 所述探针的核酸序列如SEQ  ID NO:12所 示。 7.根据权利要求6所述的试剂盒， 其特征在于， 所述SEQ  ID NO:12所示探针的5 ’端标记 CY5荧光基团， 3 ’端标记BHQ2淬灭基团。 8.非诊断目的检测甲型流感病毒、 乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的方法， 其特征在 于， 采用权利要求3～6任一项所述的试剂盒对样本核酸进行检测， 根据荧光信号判断样品 是否存在甲型流感病毒、 乙型流感病毒或呼吸道合胞病毒。 9.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 所述PCR反应液还包括PCR缓冲液、 dNTPs、 DNA聚合酶和反转录酶， 将所述PCR缓冲液、 DNA聚合酶、 反转录酶和样本核酸按以下反应体 系的配比配制成核酸扩增反应混合液进 行PCR反应， 所述反应体系的配比如下： 5 ×PCR缓冲 液， 5μL； 5U/ µLDNA聚合酶， 0.3 µL； 200U/µL反转录酶， 0.3 µL； dNTPs， 0.20~0.40 mM； SEQ ID  NO:1， 0.30~0.50 μM； SEQ ID NO:2， 0.30~0.50 μM； SEQ ID NO:3， 0.10~0.30 μM； SEQ ID  NO:4， 0.30~0.50 μM； SEQ ID NO:5， 0.20~0.50 μM； SEQ ID NO:6， 0.10~0.30 μM； SEQ ID  NO:7， 0.20~0.50 μM； SEQ ID NO:8， 0.20~0.50 μM； SEQ ID NO:9， 0.10~0.30 μM； SEQ ID  NO:10， 0.10~0.30 μM； SEQ ID NO:11， 0.10~0.30 μM； SEQ ID NO:12， 0.05~0.30 μM； 灭菌超权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114058742 B 2纯水， 补足至15 μL； 样本核酸， 10 μL。 10.根据权利要求9所述的方法， 其特 征在于， 所述扩增的程序包括： 逆转录： 5 0℃， 5min； 预变性： 95℃， 3mi n； 变性： 95℃， 10s； 退火， 延伸及荧 光采集： 5 5℃， 30s； 45个循环。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114058742 B 3