(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210048395.7 (22)申请日 2022.01.17 (71)申请人 贵州省林业科 学研究院 地址 550005 贵州省贵阳市南明区富源南 路382号 (72)发明人 颜凤霞　江荣慧　田凡　姜运力　 杨焱冰　 (74)专利代理 机构 北京高沃 律师事务所 1 1569 代理人 苏士莹 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种特异性区分翅萼石斛和黑毛石斛的引 物对、 试剂盒及其应用 (57)摘要 本发明涉及生物 技术领域， 特别是涉及一种 特异性区分翅萼石斛和黑毛石斛的引物对、 试剂 盒及其应用。 本发明对翅萼石斛和黑毛石斛的 叶 绿体基因组tRNA ‑Ser基因及tRNA ‑Ser基因和 psbZ基因之间的间隔区， 进行了测序分析， 发现 tRNA‑Ser基因及tRNA ‑Ser基因和psbZ基因之间 的间隔区在翅萼石斛和黑毛石斛之间存在显著 差异； 本发 明对上述差异序列区间设计特异性引 物对， 利用该引物对对待测石斛样品进行PCR扩 增， 根据扩增产物可以特异性区分翅萼石斛和黑 毛石斛， 可以在不是花期的时候或DNA未降解的 中药干品状态准确鉴定翅萼 石斛和黑毛 石斛。 权利要求书1页 说明书6页 序列表3页 附图1页 CN 114164297 A 2022.03.11 CN 114164297 A 1.一种特异性区分翅萼石斛和黑毛石斛的引物对， 其特征在于， 所述引物对包括上游 引物F和下游引物R； 所述上游引物F的核苷 酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 所述下游引物R的核 苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示。 2.一种特异性区分翅萼石斛和黑毛石斛的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括权利 要求1所述的引物对。 3.权利要求1所述引物对或权利要求2所述试剂盒在区分翅萼石斛和黑毛石斛中的应 用。 4.一种区分翅萼 石斛和黑毛 石斛的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 以待测样品基因组DNA为模板， 利用权利要求1所述引物对或权利要求2所述试剂盒配 制PCR反应 体系， 进行PCR扩增； 若扩增产物的长度为90 0～1000bp， 则待测样品为 翅萼石斛； 若扩增产物的长度为 400～500bp， 则待测样品为 黑毛石斛。 5.根据权利 要求4所述的方法， 其特征在于， 所述PCR扩增的反应程序包括： 95℃预变性 5min； 95℃变性3 0s； 56℃退火3 0s， 72℃延伸5 0s， 30个循环； 72℃延伸10mi n。 6.根据权利要求4或5所述的方法， 其特征在于， 所述PCR扩增的反应体系以20μL计， 包 括模板0.5 μL、 上游引物1 μL、 下游引物1 μL、 10 ×TaqBuffer2.0 μl、 Taq酶0.2 μl、 dNTPMix  1.6 μl和剩余d dH2O。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述上游引物和下游引物 的浓度均为10μ mol/L； 所述模板的浓度为5 0～200ng/ μl。 8.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述Taq酶的酶活为5U、 所述dNTPMix的浓 度为2.5m mol/L。 9.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 所述扩增产物的鉴定方法包括电泳或测 序； 当鉴定方法为测序时， 若扩增产物的序列与CE序列一致的支持率大于99％， 则待测样 品为翅萼石斛； 所述C E序列如SEQ  ID NO.3所示； 若扩增产物的序列与HM序列一致的支持率大于99％， 则待测样品为黑毛石斛； 所述HM 序列如SEQ  ID NO.4所示。 10.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 所述待测样品包括新鲜组织和/或DNA未 降解的干品组织。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114164297 A 2一种特异性区分翅萼石斛和黑毛石斛的引物对、 试剂盒及其 应用 技术领域 [0001]本发明涉及 生物技术领域， 特别是涉及一种特异性区分翅萼石斛和黑毛石斛的引 物对、 试剂盒及其应用。 背景技术 [0002]石斛属Dendrobium  Sw.是兰科三大属之一， 其原种将近2000种， 中国有78种。 石斛 属植物多数都具有很高的药用价值和观赏价值。 翅萼石斛(Dendrobium  cariniferum)为石 斛属植物中观赏价值较高的一个种， 其花型优美， 花色艳丽， 花具有橘子香气， 花期 长， 可达 2～3个月， 是很好的育种亲本。 黑毛石斛(Dendrobium  williamsonii)和翅萼石斛从外 形上 看， 非常相似， 只有花上有区别。 从形态上识别黑毛石斛和翅萼石斛， 花瓣与萼片 近等宽， 萼 片背面中肋不明显隆起， 子房非三棱形的为黑毛石斛， 否则为翅萼石斛。 由于形态上的区别 不明显， 只有在花期才能区别翅萼石斛和黑毛石斛， 而且， 经研究表明， 翅萼石斛和黑毛石 斛都具有药效功能， 若做成中药干品更是难以区分， 所以经常会出现将二者混淆 的现象或 根本没有办法准确鉴别二者。 因此， 有必 要探索一种不在花期或 中药干品状态(DNA未降解) 下准确鉴定翅萼 石斛和黑毛 石斛的方法。 发明内容 [0003]为了解决上述问题， 本发明提供了一种特异性区分翅萼石 斛和黑毛石斛的引物对 及其应用。 本发明提供 的引物对可以特异性区分翅萼石斛和黑毛石斛， 可以在不是花期的 时候或DNA未降解的中药干品状态准确鉴定翅萼 石斛和黑毛 石斛。 [0004]为了实现上述目的， 本发明提供如下技 术方案： [0005]本发明提供了一种特异性区分翅萼石 斛和黑毛石斛的引物对， 所述引物对包括上 游引物F和下游引物R； 所述上游引物F的核苷 酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 所述下游引物R的 核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示。 [0006]本发明还提供了一种特异性区分翅萼石斛和黑毛石 斛的试剂盒， 所述试剂盒包括 上述的引物对。 [0007]本发明还提供了上述引物对或上述试剂盒在区分翅萼 石斛和黑毛 石斛中的应用。 [0008]本发明还提供了一种区分翅萼 石斛和黑毛 石斛的方法， 包括以下步骤： [0009]以待测样品基因组DNA为模板， 利用上述引物对或上述试剂盒配制PCR反应体系， 进行PCR扩增； [0010]若扩增产物的长度为90 0～1000bp， 则待测样品为 翅萼石斛； [0011]若扩增产物的长度为 400～500bp， 则待测样品为 黑毛石斛。 [0012]优选的， 所述PCR扩增的反应程序包括： 95℃预变性5min； 95℃变性30s； 56℃退火 30s， 72℃延伸5 0s， 30个循环； 72℃延伸10mi n。 [0013]优选的， 所述PCR扩增的反应体系以20 μL计， 包括模板0.5 μL、 上游引物1 μL、 下游引说　明　书 1/6 页 3 CN 114164297 A 3