(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210051549.8 (22)申请日 2022.01.17 (71)申请人 广西壮族自治区药用植物园 地址 530023 广西壮 族自治区南宁市 兴宁 区长堽路189号 (72)发明人 姜建萍　 (74)专利代理 机构 广西南宁公平知识产权代理 有限公司 45104 代理人 蓝文苑 (51)Int.Cl. C07K 14/435(2006.01) C12N 15/12(2006.01) C12Q 1/6879(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 罗氏沼虾雄性生殖相关蛋白的基因合成引 物组及其应用 (57)摘要 本发明公开的一种罗氏沼虾雄性生殖相关 蛋白的基因合成引物组及其应用， 通过， 罗氏沼 虾雄性生殖相 关蛋白氨基酸序列如SEQ  ID NO： 18所示， 编码基因的核苷酸序列为SEQ  ID NO： 17 所示， 扩增该编码基因合成引物组包括接头引 物、 中间序列扩增引物、 3 ’RACE引物和5 ’RACE引 物， 还提供了利用编码基因合 成引物组克隆罗氏 沼虾雄性生殖相关蛋白基因的方法， 本发明在指 导罗氏沼虾性别控制方面具有重要的应用价 值。 权利要求书2页 说明书8页 序列表9页 附图2页 CN 114316010 A 2022.04.12 CN 114316010 A 1.罗氏沼虾雄 性生殖相关蛋白， 其特 征在于， 其氨基酸序列如SEQ  ID NO： 18所示。 2.如权利要求1所述的罗氏沼虾雄性生殖相关蛋白的编码基因， 其特征在于， 该编码基 因的核苷酸序列为SEQ  ID NO： 17所示。 3.如权利要求2所述的罗氏沼虾雄性生殖相关蛋白的编码基因在罗氏沼虾性别控制中 的应用。 4.用于扩增权利要求1所述的罗氏沼虾雄性生殖相关蛋白的编码基因合成引物组， 其 特征在于， 所述引物组包括接头引物、 中间序列扩增引物、 3 ’RACE特异性引物和5'RACE特异 性引物， 所述接头引物包括5'adap tor引物、 3'a daptor引物、 5.3 ’outer引物和5.3'inner引 物， 它们的核甘酸序列如SEQ  ID No.1～4所示， 中间序列扩增引物包括1F引物、 1R引物、 2F 引物、 2R引物、 3F引物、 3R引物、 4F引物和4R引物， 它们的核甘酸序列如SEQ  ID No.5～12所 示， 所述3 ’RACE特异性引物包括RC ‑3F1引物和RC ‑3F2引物， 它们的核甘酸序列如SEQ  ID  No.13～14， 所述5 ’RACE特异性引物包括RC ‑5R1引物和RC ‑5R2引物， 它们的核甘酸序列如 SEQ IDNo.15～16所示。 5.如权利要求4所述的引物组在罗氏沼虾雄性生殖相关蛋白的基因克隆及单性化养殖 方面的应用。 6.应用权利要求 4所述的引物组控制罗氏沼虾性别的方法。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述中间序列扩增引物分别进行PCR扩增 程序， 所述中间序列扩增引物的PCR反应体系为中间序列扩增引物12.5 μl、 上游引物(10 μM) 0.5 μl、 下游引物(10 μM)0.5 μl、 dNTP(10mM)0.2 μl、 ddH2010.1μl、 cDNA模板1μl、 Taq酶(5U/ μ l)0.2 μl、 总体积2 5 μl； PCR扩增程序为9 5℃预变性3min、 94℃变性30s、 58℃退火30s、 72℃延 伸90s、 72℃修复延伸7mi n共33个循环。 8.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 以所述3 ’adaptor引 物为反转引物的cDNA 为模版进行3 ’RACE巢氏PCR扩增， 3'RACE巢氏PCR反应体系包括第一轮和第二轮， 第一轮的 PCR反应体系为2X  GC Buffer I 12.5μl、 RC ‑3F1(10μM)0.5μl、 5.3'outer(10μM)0.5μl、 dNTP(2.5mM)4 μl、 d dH20 6.3 μl、 cDNA模板1 μl、 Taq酶(5U/ μl)0.2 μl和Total  25 μl； 第二轮的PC R反应体系为2X  GC Buffer I 25 μl、 RC‑3F2(10 μM)1 μl、 5.3 ’inner(10 μM)1 μl、 dNTP(2.5mM)8 μl、 ddH2 0 12.5 μl、 cDNA模板1 μl(第一轮PCR稀释产物)、 Taq酶(5U/ μl)0.5 μl和Total  50 μl； 第一轮和第二轮的3 ’RACE巢氏的PCR扩增程序分别为95℃预变性3min、 94℃变性30s、 58℃退火3 0s、 72℃延伸6 0s、 72℃修复延伸7mi n共循环3 3次。 9.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 以所述RC ‑5R2引物、 RC ‑5R1引物反转， 得到 cDNA， 经RNase H和TdT处理后， 进行5 ’RACE巢氏PCR， 所述5 ’RACE巢氏PCR反应体系包括第一 轮和第二轮， 第一轮的PCR反应体系为2X  GC Buffer I 12.5μl、 5 ’adaptor(10μM)0.5μl、 RC‑5R1(10 μM)0.5 μl、 dNTP(2.5mM)4 μl、 ddH20  6.3 μl、 cDNA模板1 μl、 Taq酶(5U/ μl)0.2 μl和 Total 25 μl； 第二轮的PC R反应体系为2X  GC Buffer I 25 μl、 5.3'out er(10 μM)1 μl、 RC ‑5R2(10 μM)1 μl、 dNTP(2.5mM)8 μl、 ddH2 0 12.5 μl、 cDNA模板1 μl(第一轮PCR稀释产物)、 Taq酶(5U/ μl)0.5 μl和Total  50 μl； 第一轮和第二轮的5'RACE的巢氏PCR扩增程序分别为95℃预变性3min、 94℃变性30s、权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114316010 A 258℃退火3 0s、 72℃延伸6 0s、 72℃修复延伸7mi n共循环3 3次。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114316010 A 3