(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210044243.X (22)申请日 2022.01.14 (71)申请人 广东一方制药有限公司 地址 528244 广东省佛山市南海区里 水镇 旗峰工业 开发区 (72)发明人 罗宇琴　李国卫　谭斯尹　邢菊玲　 宋叶　魏梅　陈向东　孙冬梅　 (74)专利代理 机构 华进联合专利商标代理有限 公司 44224 代理人 王秉丽 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 鳖甲及其饮片、 中药配方颗粒和其他水提物 制品的特异性 鉴别引物对及其应用、 鉴别方法 (57)摘要 本发明涉及一种鳖甲及其饮片、 中药配方颗 粒和其他水提物制 品的特异性鉴别引物对及其 应用、 鉴别方法。 所述特异性鉴别引物对包含碱 基序列如SEQ  ID NO:1所示的正向引物以及碱基 序列如SEQ  ID NO:2所示的反向引物。 采用该特 异性鉴别引物对对鳖甲的水提取物制品DNA进行 扩增， 所得扩增产物不仅能用于鳖甲及其饮片的 鉴别， 还能用于鳖甲及其饮片的中药标准汤剂及 其他水提取物制品的鉴别， 使 其与伪品的水提取 物制品区别开来， 解决了水提取物制品在失去形 态后难以鉴别的难题。 以该特异性鉴别引物对进 行鉴别， 专属性好， 结果准确度高， 为鳖甲及其饮 片的中药标准汤剂和其他水提取物制 品的用药 安全与临床疗效提供保障。 权利要求书1页 说明书11页 序列表1页 附图1页 CN 114350819 A 2022.04.15 CN 114350819 A 1.一种鳖甲及其饮片、 中药配方颗粒和其他水提物制品的特异性鉴别引物对， 其特征 在于， 所述特异性鉴别引物对包含碱基序列如SEQ  ID NO:1所示的正 向引物以及碱基序列 如SEQ ID NO:2所示的反向引物。 2.一种鳖甲及其饮片、 中药配方颗粒和其他水提物制品的特异性鉴别试剂盒， 其特征 在于， 所述试剂盒包 含权利要求1所述的特异性 鉴别引物对， 以及扩增试剂。 3.根据权利要求2所述的鳖甲及其饮片、 中药配方颗粒和其他水提物制品的特异性鉴 别试剂盒， 其特征在于， 所述扩增试剂包含扩增缓冲液、 dNTP、 DNA聚合酶和水； 所述扩增缓 冲液为10 ×PCR Buffer I， 所述DNA聚合酶为Taq酶。 4.一种鳖甲、 鳖甲饮片、 鳖甲中药配方颗粒或其他鳖甲水提物制品的特异性鉴别方法， 其特征在于， 所述特异性 鉴别方法包括如下步骤： 提取待测样品的DNA； 采用权利要求1所述的特异性鉴别引物对或者权利要求2或者3所述的特异性鉴别试剂 盒对所述DNA进 行扩增， 分离所得扩增产 物， 根据所得分离产 物对所述待测样品进 行特异性 鉴别。 5.根据权利要求4所述的鳖甲、 鳖甲饮片、 鳖甲中药配方颗粒或其他鳖甲水提物制品的 特异性鉴别方法， 其特 征在于， 根据所 得分离产物对所述待测样品进行 特异性鉴别包括： 若所述分离产物包 含236bp片段， 则说明所述待测样品包 含鳖甲； 若所述分离产物不包 含236bp片段， 则说明所述待测样品包 含鳖甲伪品或者 不含鳖甲。 6.根据权利要求5所述的鳖甲、 鳖甲饮片、 鳖甲中药配方颗粒或其他鳖甲水提物制品的 特异性鉴别方法， 其特征在于， 所述鳖 甲伪品选自龟甲、 角鳖甲、 佛罗里达鳖 甲和山瑞鳖 甲 中一种或者多种。 7.根据权利要求5所述的鳖甲、 鳖甲饮片、 鳖甲中药配方颗粒或其他鳖甲水提物制品的 特异性鉴别方法， 其特 征在于， 所述 其他鳖甲水提物制品包 含鳖甲中药 标准汤剂。 8.根据权利要求4至7任一项所述的鳖甲、 鳖甲饮片、 鳖甲中药配方颗粒或其他鳖甲水 提物制品的特异性 鉴别方法， 其特 征在于， 扩增的退火温度为59℃～61℃。 9.根据权利要求8所述的鳖甲、 鳖甲饮片、 鳖甲中药配方颗粒或其他鳖甲水提物制品的 特异性鉴别方法， 其特征在于， 扩增的反应体系包含： 2.5μL含Mg2+的10×PCR Buffer I、 2.5mmol/L  dNTP、 10μmol/L正向引物、 10μmol/L反向引物、 5U/μL  Taq酶、 30ng～50ng模板 DNA和19.2 μL水。 10.根据权利要求8所述的鳖甲、 鳖甲饮片、 鳖甲中药配方颗粒或其他鳖甲水提物制品 的特异性鉴别方法， 其特征在于， 扩增的反应程序包括： 95℃预变性5min； 95℃变性30s， 60 ℃退火30s， 72℃延伸3 0s， 共33个循环； 最后72℃延伸5mi n。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114350819 A 2鳖甲及其饮片、 中药配方颗粒和其他水提物制品的特异性 鉴 别引物对及其应用、 鉴别方 法 技术领域 [0001]本发明涉及中药质量检测技术领域， 特别涉及一种鳖甲及其饮片、 中药配方颗粒 和其他水提物制品的特异性 鉴别引物对及其应用、 鉴别方法。 背景技术 [0002]中国药典2020年版规定， 鳖甲来源鳖科动物鳖(Trionyx  sinensis  Wiegmann)的 背甲。 鳖甲， 始载于汉代 《神农本草经》 ， 列为中品， 历代本草都有记载， 具有滋阴潜阳、 退热 除蒸、 软坚散结等功效， 常用于阴虚发热、 骨蒸劳热、 阴虚阳亢、 头晕目眩、 虚 风内动、 手足瘈 疭等症。 现代药理学研究证实， 鳖甲具有抗肿瘤、 免疫调节、 抗 肝硬化、 保肝 等作用。 [0003]鳖甲作为常用中药， 现市场上以同属和其混伪品做鳖甲药用情况较为普遍， 如龟 甲(Chinemys  reevesii(Gray))、 角鳖(Apalone  spinifera)甲、 佛罗里达鳖(Apalone   ferox)甲、 山瑞鳖(Trionyx  steindachneri)、 缘板鳖(Lissemys  punctata)甲、 宏鳖 (Trionyx  hurum)甲、 平鳖(又称马来鳖， Do gania subplana)甲、 鼋(Pelochelys  bibroni) 甲、 巨鳖(Trionyx  gangeticus)甲、 非洲鳖(Trionyx  triunguis)甲等， 它们性状接近， 形态 相似， 依靠传统的鉴别方法难度较大， 鉴别准确性低， 尤其是经过醋制成炮制品、 经水提制 成中药标准汤剂并进一步加工成中药配方颗粒后， 由于失去药材性状， 更加难以进行有效 的鉴别。 为保证鳖甲的临床用药质量和疗效， 准确、 快速地 实现鉴别鳖甲及其饮片的水提取 物制品(包括中药 标准汤剂和中药配方颗粒)是非常必要的。 发明内容 [0004]基于以上技术问题， 本发明的目的之一是提供一种特异性鉴别引 物对， 采用该特 异性鉴别引物对对鳖甲的中药标准汤剂或者其他鳖甲水提取物制品DNA进行扩增， 所得扩 增产物能用于鳖甲及其饮片的水提取物制品如中药标准汤剂和中药配方颗粒的鉴别， 使其 与伪品的水提取物制品区别开 来。 [0005]本发明的目的可以通过以下技 术方案实现： [0006]一种鳖甲及其饮片、 中药配方颗粒和其他水提物制品的特异性鉴别引 物对， 所述 特异性鉴别引物对包含碱基序列如SEQ  ID NO:1所示的正向引物以及碱基序列如SEQ  ID  NO:2所示的反向引物。 [0007]一种鳖甲及其饮片、 中药配方颗粒和其他水提物制品的特异性鉴别试剂盒， 所述 试剂盒包 含所述的特异性 鉴别引物对， 以及扩增试剂。 [0008]在其中一个实施例中， 所述扩增试剂包含扩增缓冲液、 dNTP、 D NA聚合酶和水； 所述 扩增缓冲液为10 ×PCR Buffer I， 所述DNA聚合酶为Taq酶。 [0009]一种鳖甲、 鳖甲饮片、 鳖甲中药配方颗粒或其他鳖甲水提物制品的特异性鉴别方 法， 所述特异性 鉴别方法包括如下步骤： [0010]提取待测样品的DNA；说　明　书 1/11 页 3 CN 114350819 A 3