(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210041734.9 (22)申请日 2022.01.14 (71)申请人 苏州大学 地址 215008 江苏省苏州市相城区济学路8 号 (72)发明人 汪维鹏　邱天　熊康平　杨曼　 王猛猛　 (74)专利代理 机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 11227 代理人 常亮 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 外泌体microRNA和mRNA的应用及其试剂盒 (57)摘要 本发明涉及生物 技术领域， 尤其涉及外泌体 microRNA和mRNA的应用及其试剂盒。 本发明通过 试验证明了尿液外泌体miR ‑1307‑3p和KIF5C在 正常人和帕金森氏病患者中表达存在显著差异， 说明其可以成为筛查和/或诊断帕金森氏病的分 子标志物， 两种分子标志物组合可以准确地区分 帕金森氏病患者和健康人， 实现帕金森氏病的早 期筛查和诊断。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图3页 CN 114214404 A 2022.03.22 CN 114214404 A 1.外泌体miR ‑1307‑3p和/或KIF5C  mRNA作为分子标志物在制备筛查和/或诊断帕金森 氏病的产品中的应用。 2.检测外泌体miR ‑1307‑3p和/或KIF5C 的试剂在制备筛查和/或诊断帕金森氏病的产 品中的应用。 3.根据权利要求1或2所述的应用， 其特征在于， 所述miR ‑1307‑3p的序列如SEQ  ID  NO.1所示。 4.根据权利要求1或2所述的应用， 其特 征在于， 所述KIF5 C为全长序列。 5.根据权利要求1或2所述的应用， 其特 征在于， 所述外泌体为尿液外泌体。 6.根据权利要求1或2任一项所述的应用， 其特 征在于， 所述产品为试剂盒。 7.根据权利要求6所述的应用， 其特征在于， 所述试剂盒为实时荧光定量PCR检测试剂 盒。 8.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于， 所述实时荧光定量PCR检测试剂盒包括扩 增miR‑1307‑3p和/或KIF5 C mRNA的引物。 9.一种筛查和/或诊断帕金森氏病的实时荧光定量PCR检测试剂盒， 其特征在于， 包括 扩增外泌体miR ‑1307‑3p和/或KIF5C的系统及其相对定量内参标准化系统、 尿液外泌体提 取系统、 外泌体RNA提取系统和反转录系统。 10.根据权利要求9所述的实时荧光定量PCR检测试剂盒， 其特征在于， 所述miR ‑1307‑ 3p的序列的相对定量内参标准 化系统由U6组成； 所述KIF5 C的相对定量内参标准 化系统由GAP DH组成； 所述尿液外泌体提取系统包括金属有机骨架材 料uio‑66； 所述外泌体总RNA提取系统包括RNAiso  Plus裂解液、 三氯甲烷、 异丙醇、 RNase ‑free  ddH2O； 所述反转录扩增系统包括RNA模板、 Random/Oligo(dT)引物、 miR ‑1307‑3p引物、 U6引 物、 dNTPMix、 反转录酶、 5 ×反转录缓冲液、 RNA酶抑制剂、 无RNA酶的去离 子水； 所述荧光定量PCR扩增系统包括反转录扩增得到的cDNA模板、 SYBR  Green混合液、 miR ‑ 1307‑3p引物、 KIF5 C引物、 超纯 水。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114214404 A 2外泌体microRNA和mRNA的应用及其试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及生物技 术领域， 尤其涉及外泌体microRNA和mRNA的应用及其试剂盒。 背景技术 [0002]帕金森氏病(Parkinson ’s disease， PD)是一种常见的神经系统变性疾病， 老年人 多见， 平均发病年龄为60岁左右， 40岁以下起病的青年帕金森氏病较少见。 帕金森氏病的临 床表现主要包括静止性震颤、 运动迟缓、 肌强直和姿势步态障碍， 同时患者可伴有抑郁、 便 秘和睡眠障碍等 非运动症状。 帕金森氏病的诊断主要依靠病史、 临床症状及体征。 一般的辅 助检查多无异常改变。 药物治疗是帕金森氏病最主要的治疗手段， 左旋多巴制剂仍是最有 效的药物。 手术治疗 是药物治疗的一种有效补充。 康复治疗、 心理治疗及良好的护理也能在 一定程度上改善症状。 目前应用的治疗手段虽然只能改善症状， 不能阻止病情的进展， 也无 法治愈疾病。 因此， 帕金森氏病的早期诊断和早期治疗有助于延缓病情进展， 提高患者生存 质量。 [0003]外泌体(exosome)是一些小的、 由细胞分泌且有膜包裹的亚细胞结构， 包含有RNA 和蛋白质， 其直径通常为30 ‑150nm。 现今， 外泌体特指直径在40 ‑100nm的盘状囊泡。 1983年， 外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现， 1987年Johnstone将其命名为 “exosome”。 多种细 胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。 其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊 泡体， 经多囊泡体外膜与细胞膜融合后 释放到胞外基质中。 外泌体天然存在于体液中， 包括 血液、 唾液、 尿液、 脑 脊液和乳汁中。 近年来， 基于外泌体寻找特定疾病的相关生物标志物逐 渐引起研究人员的关注。 特别是2007年发现外泌体含有丰富的小RNA， 尤其是microRNA之 后， 利用外泌体microRNA筛查疾病的相关分子标志物得到了长足 的发展。 MicroRNA是一些 小的非编码RNA， 长度在21 ‑25个碱基。 microRNA靶向针对信使RNA3 ’非翻译区来抑制相关基 因翻译。 即使大量核酶存在， micr oRNA也依然稳定存在于各类体液中， 因而被广泛用作生物 标志物。 [0004]KIF5C编码的蛋白是驱动蛋白的一条重链的亚基， 参与中枢神经系统内的物质传 输。 该蛋白通过与另一条重链和 两条轻链结合而作为四聚体与酪蛋白激酶II(CK2)相互作 用。 该基因的突变与皮质发育不良合并其 他脑畸形有关。 发明内容 [0005]有鉴于此， 本发明目的在于提供外泌体miR ‑1307‑3p和/或KIF5C作为分子标志物 在制备筛查和/或诊断帕金森氏病的产品中的应用， 以及检测外泌体miR ‑1307‑3p和/或 KIF5C的试剂在制备筛查和/或诊断帕金森氏病的产品中的应用。 [0006]外 泌体m iR ‑1 3 07‑3 p为m i c roR N A分 子标 志 物 ， 其 核 苷酸 序 列为 ACUCGGCGUGGCGUCGGUCGUG(SEQ  ID NO.1)。 [0007]KIF5C为mRNA分子标志物， 全称是KinesinFamilyMember  5C， 为KIF5C的mRNA全长， 长度为6954bp。说　明　书 1/5 页 3 CN 114214404 A 3