(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210044312.7 (22)申请日 2022.01.14 (71)申请人 齐鲁工业大学 地址 250353 山东省济南市长清区大 学路 3501号 (72)发明人 周明扬　刘晓雨　楚天歌　曹炜彤　 孙诗泽　 (74)专利代理 机构 济南圣达知识产权代理有限 公司 372 21 代理人 宋海海 (51)Int.Cl. C12N 15/55(2006.01) C12N 9/18(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/70(2006.01)C12N 1/21(2006.01) C12P 7/62(2022.01) C12P 7/6445(2022.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 一种南极土壤来源的酯酶及其编码基因与 应用 (57)摘要 本发明提供一种南极土壤来源的酯酶及其 编码基因与应用， 属于基因工程和酶工程技术领 域。 本发明从南极乔治王岛土壤中分离获得一株 产酯酶菌株Pseudomonas  sp.Soil2， 确定了其基 因组中编码酯酶的基因片段Est ‑soil2， 以及 Est‑soil2的核酸序列， 并成功克隆了码南极土 壤来源酯酶Est ‑soil2的基因， 构建了含南极土 壤来源酯酶基因Est ‑soil2的表达 载体以及含有 该表达载体的大肠杆菌重组细胞。 该酯酶属于 冷 适应性酯酶， 在10～30℃范围内有很好的催化性 能， 在0℃时仍有活性， 同时能耐受pH6～10的酸 碱性， 在强碱性和弱酸性条件下活性极强， 因此 在不耐高温的化学品合成过程中有应用潜力。 权利要求书1页 说明书7页 序列表3页 附图3页 CN 114164223 A 2022.03.11 CN 114164223 A 1.一种酯酶编码基因， 其特征在于， 所述编码基因具有(a1) ‑(a3)中任一所述核苷酸序 列： (a1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列； (a2)与(a1)互补的核苷酸序列； (a3)与(a1)或(a2)所示的核苷酸序列具有≥90％一致性且编码相同功能蛋白质的核 苷酸序列。 2.一种酯酶， 其特 征在于， 其氨基酸序列为如下(b1) ‑(b3)中任一项： (b1)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b2)将(b1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同生物 活性的由其衍生的蛋白质； (b3)其它基因编码的与SEQ  ID NO.2所示的氨基酸序列组成具有相似性达到50％以上 并且具有SEQ  ID NO.2所示的蛋白的活性的蛋白。 3.基于权利要求1所述酶编码基因所设计的扩增引物。 4.如权利要求3所述扩增引 物， 其特征在于， 所述扩增引 物包括SEQ  ID NO.3‑4所示序 列。 5.含有权利要求1所述酶编码基因的重组表达载体。 6.如权利要求5所述的重组表达载体， 其特征在于， 所述重组表达载体是通过将权利要 求1所述编码基因有效的连接 到表达载体上获得； 优选的， 所述表达载体为病毒载体、 质粒、 噬菌体、 噬菌粒、 黏粒、 F黏粒、 噬菌体或人工 染色体中的任意一种或多种； 病毒载体包括腺病毒载体、 逆转录病毒载体或腺伴 随病毒载 体， 人工染色体包括细菌人工染色体、 噬菌体P1衍生的载体、 酵母人工染色体或哺乳动物人 工染色体； 进一步优选为细菌质粒； 更进一 步优选为pMAL ‑c2x质粒。 7.含有权利要求1所述的编码基因的宿主。 8.如权利要求7所述宿主， 其特征在于， 所述宿主包括细菌、 真菌和真核细胞， 进一步选 自埃希氏大肠杆菌、 芽孢杆菌、 枯草芽孢杆菌、 酿 酒酵母、 里氏木霉和草酸青霉； 更进一步优 选为大肠杆菌 。 9.权利要求2所述酯酶在水解制备酯类及其 衍生物中的应用。 10.如权利要求9所述应用， 其特征在于， 所述酯类为短链酯类， 优选的， 所述短链酯类 为碳链长度为6～8个碳原子的酯类化 合物； 优选的， 所述应用在低温环境中进行， 所述低温环境为不高于30℃， 包括0 ‑30℃， 进一 步优选为10 ‑30℃； 优选的， 所述应用在酸性(包括弱酸性)或碱性(包括强碱性)环境中进行， 优选pH为6 ‑ 10。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114164223 A 2一种南极土壤来源的酯 酶及其编码基因与应用 技术领域 [0001]本发明属于基 因工程和酶工程技术领域， 具体涉及一种南极土壤来源的酯酶及其 编码基因与应用。 背景技术 [0002]公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解， 而不必然 被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技 术。 [0003]酯酶(esterase)可以催化酯键的水解和合成， 作用底物广泛。 具有冷适应性的酯 酶可以应用于反应条件严苛的生产过程， 一些酯酶具有良好的区域选择性和 立体选择性， 能够作为催化合成光学纯化合物的潜在生物催化剂 。 而且酯酶发挥催化作用不需要额外的 辅助因子， 对一些有机试剂有一定的耐受， 可以广泛作用于多种底物， 已经成为多种化学过 程和工业生产中应用广泛的一类生物催化剂 。 酯酶在自然界中广泛存在， 其中， 以微生物 来 源的酯酶数目最大， 应用最广。 在之前报道过的微生物来源的酯酶 中， 大部分的作用条件都 比较温和， 不适应于工业化生产， 只有一小部分可以应用于工业生产领域中。 因而， 新型酯 酶的发掘成为 开发工业酶制剂亟 待解决的问题。 [0004]在各种极端条件下也有微生物的存在， 这些微生物在极端环境中的生存和繁殖的 能力是各种生理适应和酶分子进化的结果。 因而， 极端 条件下的微生物迫于生存压力， 可能 会进化出多种极端适应性的酶类。 极端条件下的微 生物资源， 也成为蕴含新型酯酶的宝库。 [0005]南极洲全洲 平均气温可达到 ‑25℃， 常年寒冷， 南极地区的土壤是就是在这样恶劣 的条件下形成的。 特殊的气候条件导致南极几乎没有大型植物生长， 微生物在土壤生态系 统中占据着绝对的优势地位。 南极微生物资源成了极端条件适应性酯酶的资源宝库， 为开 展新型酯酶的发掘提供了 很好的样品来源。 [0006]南极极端严寒的环境条件， 可能造就了一些具有冷适应性的酯酶。 冷适应性酯酶 可以更好地催化不耐热化合物， 同时， 可以避免反应混合物加热和热不稳定化合物失活时 的能量损失。 具有新型性能的适冷性酯酶具有更加广阔的应用前景， 冷适应酯酶被应用于 低温工业反应中。 总的来说， 冷适应性酯酶在生物技 术应用中是很有前途的资源。 发明内容 [0007]为了克服上述技术问题， 本发明提供一种南极土壤来源的酯酶及其编码基因与应 用。 本发明从南极乔治王岛土壤中分离获得一株产酯酶菌株Pseudomonas  sp.Soil2， 通过 对该菌株进行全基因组测序， 确定了其基因组中编码酯酶的基因片段Est ‑soil2， 以及Est ‑ soil2的核酸序列， 并成功克隆了码南极土壤来源酯酶Est ‑soil2的基因， 构建了含南极土 壤来源酯酶基因Est ‑soil2的表达载体以及含有该表达载体的大肠杆菌重组细胞。 该酯酶 属于冷适应性酯酶， 在10～30℃范围内有很好的催化性能， 在0℃时仍有活性， 同时能耐受 pH6～10的酸碱性， 在强碱性和弱酸性条件 下活性极强， 因此在不耐高温的化学品合成过程说　明　书 1/7 页 3 CN 114164223 A 3