(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210027140.2 (22)申请日 2022.01.11 (71)申请人 杭州百迈生物 股份有限公司 地址 310000 浙江省杭州市大江东产业 集 聚区临江高新区纬五路3688号科创园 2幢四层 (72)发明人 丁佳女　郑宜文　 (74)专利代理 机构 杭州裕阳联合专利代理有限 公司 33289 代理人 田金霞 (51)Int.Cl. C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于CYP3A5多态性位点基因分型检测的试 剂盒及其检测方法 (57)摘要 本发明提供了用于CYP3A5多态性位点基因 分型检测的试剂盒及其检测方法， 包括： 野生型 检测序列1、 野生型检测序列2、 突变型检测序列1 与突变型检测序列2。 本发明将引物结合序列和 探针结合序列整合到一起， 猝灭效果不是很理 想， 所以在序列的设计过程中引入了双猝灭基 团， 提高反应灵敏度， 降低本底信噪； 为了提高杂 交的特异性， 在原有MGB探针的基础上， 在引物后 半部区域引入rna碱基， 用于区别SNP分型检测位 点， 在RNA修饰的碱基的上游引入突变设计， 是为 了进一步提高反应的特异性。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图6页 CN 114182003 A 2022.03.15 CN 114182003 A 1.用于CYP3A5多态性位点基因分型检测的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括： 野生 型检测序列1、 野生型检测序列2、 突变型检测序列1与突变型检测序列2； 所述野生型检测序列1、 所述野生型检测序列2中从5'端依次包括引物通用 序列区域、 引物序列与野生型探针序列的共用区域， rna碱基、 第一淬灭基团与3'端； 所述突变型检测 序列1与所述突变型检测序列2中， 从5'端依次包括引物通用序列区域、 引物序列与突变型 探针序列的共用区域， rna碱基、 第一淬灭基团与3'端； 5'端具有荧 光基团， 3'端具有第二淬灭基团。 2.根据权利 要求1所述的用于CYP3A5多态性位点基因分型检测的试剂盒， 其特征在于， 所述rna碱基的为待检测的SNP分型位 点。 3.根据权利 要求1所述的用于CYP3A5多态性位点基因分型检测的试剂盒， 其特征在于， 所述第一淬灭基团包括ZENTMDouble‑Quenched Probe或DBQ1。 4.根据权利 要求1所述的用于CYP3A5多态性位点基因分型检测的试剂盒， 其特征在于， 所述第二淬灭基团包括MGB。 5.根据权利要求1 ‑4任一项所述的用于CYP3A5多态性位点基因分型检测的试剂盒， 其 特征在于， 所述野生型检测序列1如SEQ  ID NO:1所示， 所述野生型检测序列2如SEQ  ID NO: 2所示， 所述野生型探针序列如SEQ  ID NO:3所示与所述突变型检测序列1如SEQ  ID NO:4所 示。 6.一种CYP3A5多态性位点基因分型检测方法， 其特征在于， 使用权利要求1 ‑5任一项所 述的试剂盒。 7.根据权利 要求5所述的一种CYP3A5多态性位点基因分型检测方法， 其特征在于， 包括 以下步骤： 1)设计， 合成， 扩增序列： 在序列中引入rna碱基以及第一淬灭基团， 合成所述的野生型 检测序列1、 野生型检测序列2、 突变型检测序列1与突变型检测序列2； 2)将步骤1)得到的野生型检测序列1或野生型检测序列2和突变型检测序列1或突变型 检测序列2进行ARMS ‑PCR扩增反应。 8.根据权利 要求7所述的一种CYP3A5多态性位点基因分型检测方法， 其特征在于， 步骤 2)的反应体系包括2*PCR  buffer、 Taq酶、 切口酶、 野生型检测序列1或野生型检测序列2、 突 变型检测序列1或突变型检测序列2、 模板DNA与纯化水。 9.根据权利 要求7所述的一种CYP3A5多态性位点基因分型检测方法， 其特征在于， 步骤 2)中扩增反应程序为： 95℃预变性5mi n， 95℃变性15s， 6 0℃退火延伸， 重复40个 循环。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114182003 A 2用于CYP3A5多态性位点 基因分型检测的试剂盒及其检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于生物技术领域， 具体涉及用于CYP3A5多态性位点基因分型检测的试剂 盒及其检测方法。 背景技术 [0002]对于CYP3A5*3基因多态性检测的方法有很多种， 如限制性长度多态性分析 (RFLP)、 直接测序 法、 印记杂交法、 T aqman技术、 等位基因特异性扩增法(ARMS)等。 其中， 最 常用的测序法能够直接检测突变位点的位置和类型， 但该方法操作步骤繁琐， 检测周期 长， 灵敏度低， 且 扩增产物容 易产生污染。 [0003]例如探针水解法， 在PC R反应系统中加入2种不同荧光标记的探针， 它们可分别与2 个等位基因完全配对。 正常情况下， 由于探针5 ′端荧光基团和3 ′端淬灭基团紧邻 在一起， 荧 光被淬灭。 随着PCR的有效进行， 与模板完全配对的探针逐步被Taq  DNA聚合酶5 ′ →3′外切 酶活性切割， 致使探针5 ′端上的荧光基团与3 ′端的淬灭基团分离， 淬灭效应解除， 报告荧光 基团被激活； 而与模板不能完全配对的探针(代表另一种等位基因)不能被有效切割， 故检 测不到荧光信号， 通过相应仪器检测荧光值的变化即可实现SNP位点检测。 目前常用的探针 修饰技术主要是MGB探针、 LNA探针和PNA探针， 它们均在一定成都上能提高反应特异性， 但 仍然在反应扩增末期容 易出现非特异性 荧光信号。 [0004]又例如ARMS ‑PCR法， 扩增阻滞突变系统PCR(Amplification  Refractory   Mutation  System PCR， ARMS ‑PCR)， 又称为等位基因特异性PCR(Allele ‑Specific  PCR， AS‑ PCR)。 ARMS ‑PCR技术建立在等位基因特异性延伸反应基础上， 只有当某个等位基因特异性 引物的3’末端碱基与突变位点处碱基互补时， 才能进行延伸反应。 常规PCR扩增DNA所用的 上、 下游引物与靶序列完全匹配， 而等位基因PCR采用等位基因特异的两条上游引物， 两者 在3’端核苷酸不同， 一个对野生型等位基因特异， 另一个对突变型等位基因特异， 在Taq   DNA聚合酶作用下， 与模板不完全匹配的上游引物将不能退火， 不能生 成PCR产物， 而与模板 匹配的引物体系则可扩增出产 物， 通过凝胶电泳或者qP CR就能很容易地分辨出扩增产 物的 有无， 从而确定SNP基因型， 目前市场主流为ARMS+qPCR技术， 采用TaqMan探针进行检测。 (比 如肿瘤靶向用药E GFR基因检测， CFDA批准的检测试剂盒， 90％以上都是ARMS检测方法)简而 言之： 引物3 ’端错配的碱基会导致PCR引物延伸速度变慢， 当错配达到一定程度时， 引物延 伸将终止， 得不到特异长度的PCR扩增产物， 从而提示模板DNA没有与引物3 ’端配对的碱基， 反之则有。 [0005]上述方法对引物设计区域序列和反应酶有严格的限制要求， 且容易产生非特异性 扩增。 发明内容 [0006]本发明的目的在于为了解决探针水解法或ARMS ‑PCR法， 对引物设计区域序列和反 应酶有严格的限制 要求， 且容易产生非特异性扩增的缺陷， 而提供一种用于CYP3A5多态性说　明　书 1/5 页 3 CN 114182003 A 3