(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210021475.3 (22)申请日 2022.01.10 (71)申请人 中国人民解 放军军事科学院军事医 学研究院 地址 100850 北京市海淀区太平路27号 (72)发明人 孙岩松　李浩　韩尧　牛梦伟　 董雪　杨兰　聂优　 (74)专利代理 机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 闫书宁 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种基于RAA-CRISPR检测SARS-CoV-2 69- 70del位点的方法 (57)摘要 本发明公开了一种用于检测SARS ‑CoV‑2  69‑70del位点的CRISPR ‑Cas13a系统。 该系统包 括RT‑RAA扩增引物、 Cas13a蛋白和crRNA； RT ‑RAA 引物对由SEQ  ID NO:7所示的单链DNA分子和SEQ   ID NO:8所示的单链DNA分子组成； SARS ‑CoV‑2  69‑70del位点 的靶点序列位于SARS ‑CoV‑2基因 组第21753 ‑21786位， 并缺失tacatg  6个碱基； SARS‑CoV‑2 69‑70del位点的crRNA序列如SEQ   ID NO:3所示。 实验证明， 本发明可实现对SARS ‑ CoV‑2 69‑70del位点核酸的高灵敏、 高特异检 测， 灵敏度达到单拷贝。 本发明具有重要的应用 价值。 权利要求书2页 说明书13页 序列表2页 附图5页 CN 114350854 A 2022.04.15 CN 114350854 A 1.一种用于检测SARS ‑CoV‑2 69‑70del位点的系统， 包括a1)或a2)： a1)RT‑RAA引物对、 Cas13a 蛋白和crRNA； a2)所述RT ‑RAA引物对和复合体； 所述复合体由Cas13a 蛋白和所述crRNA形成； 所述crRNA包括用于与Cas13a蛋白结合的锚定序列和靶向SARS ‑CoV‑2 69‑70del位点 靶点序列的向导序列； 所述SARS ‑CoV‑2 69‑70位点野生型的靶点序列位于SARS ‑CoV‑2基因组第21753 ‑21780 位； 所述SARS ‑CoV‑2 69‑70del位点的靶点序列位于SARS ‑CoV‑2基因组第21753 ‑21786位， 并缺失tacatg  6个碱基； 所述RT‑RAA引物对由SEQ  ID NO:7所示的单链DNA分子和SEQ  ID NO:8所示的单链DNA 分子组成， 用于特异性扩增SARS ‑CoV‑2 69‑70del位点的靶点序列。 2.根据权利要求1所述的系统， 其特征在于： 所述SARS ‑CoV‑2 69‑70del位点 的靶点序 列如SEQ ID NO:1所示； 所述SARS ‑CoV‑2 69‑70位点野生型的靶点序列如SEQ  ID NO:2所 示。 3.根据权利要求1所述的系统， 其特征在于： 所述SARS ‑CoV‑2 69‑70del位点的crRNA序 列如SEQ ID NO:3所示； 所述SARS ‑CoV‑2 69‑70位点野生型的crRNA序列如SEQ  ID NO:4所 示。 4.根据权利要求1所述的系统， 其特 征在于： 所述Cas13a 蛋白为LwCas13a蛋白。 5.一种用于检测SARS ‑CoV‑2 69‑70del位点的试剂盒， 其包括权利要求1 ‑4任一所述的 用于检测SARS ‑CoV‑2 69‑70del位点的系统。 6.RT‑RAA引物对， 由SEQ  ID NO:7所示的单链DNA 分子和SEQ  ID NO:8所示的单链DNA 分 子组成； 所述RT ‑RAA引物对用于特异性扩增SARS ‑CoV‑2 69‑70del位点的靶点序列。 7.如下任一应用： B1)权利要求1 ‑4任一所述的系统、 权利 要求5所述的试剂盒或权利 要求6所述RT ‑RAA引 物对在检测或辅助检测SARS ‑CoV‑2 69‑70del位点中的应用； B2)权利要求1 ‑4任一所述的系统、 权利 要求5所述的试剂盒或权利 要求6所述RT ‑RAA引 物对在制备检测或辅助检测SARS ‑CoV‑2 69‑70del位点的产品中的应用； B3)权利要求1 ‑4任一所述的系统、 权利 要求5所述的试剂盒或权利 要求6所述RT ‑RAA引 物对在检测或辅助检测待测样本中是否含有SARS ‑CoV‑2 69‑70del位点中的应用； B4)权利要求1 ‑4任一所述的系统、 权利 要求5所述的试剂盒或权利 要求6所述RT ‑RAA引 物对在制备检测或辅助检测待测样 本中是否含有SARS ‑CoV‑2 69‑70del位点的产品中的应 用； B5)权利要求1 ‑4任一所述的系统、 权利 要求5所述的试剂盒或权利 要求6所述RT ‑RAA引 物对在筛 选或辅助筛 选SARS‑CoV‑2 69‑70del位点防治药物中的应用； B6)权利要求1 ‑4任一所述的系统、 权利 要求5所述的试剂盒或权利 要求6所述RT ‑RAA引 物对在制备筛 选或辅助筛 选SARS‑CoV‑2 69‑70del位点防治药物的产品中的应用； B7)权利要求6所述RT ‑RAA引物对在制备权利要求5所述试剂盒中的应用。 8.一种检测或辅助检测SARS ‑CoV‑2 69‑70del位点的方法， 包括如下步骤： C1)以待测样本的核酸为模板， 采用由SEQ  ID NO:7所示的单链DNA 分子和SEQ  ID NO:8 所示的单链DNA分子组成的引物对进行RT ‑RAA扩增， 得到RT ‑RAA扩增产物；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114350854 A 2C2)制备检测体系， 之后进行荧光检测； 所述检测体系包括所述RT ‑RAA扩增产物、 权利 要求1‑4中任一所述的Cas13a蛋白、 权利要求1 ‑4中任一所述的crRNA、 报告RNA、 NTP、 T7RNA 聚合酶、 RNA酶抑制剂； 同时以水替代所述RT ‑RAA扩增产物作为阴性对照； C3)检测所述检测体系的荧光强度， 根据荧光强度的大小判定所述待测样本中是否含 有SARS‑CoV‑2 69‑70del位点： 对于SARS ‑CoV‑2 69‑70del位点检测， 若在同一检测时间内， 待测样本的突变检测体系的荧光 强度值比野生检测体系以及阴性对照荧光强度值高3倍以 上， 则待测样 本含有或候选含有SARS ‑CoV‑2 69‑70del位点序列， 否则待测样 本不含有或候 选不含有SARS ‑CoV‑2 69‑70del位点序列； 对于SARS ‑CoV‑2 69‑70野生位点的检测， 若在同 一检测时间内， 待测样本的野生检测体系的荧光 强度值比突变检测体系以及阴性对照荧光 强度值高3倍以上， 则待测样本含有或候选含有野生型SARS ‑CoV‑2 69‑70位点序列， 否则待 测样本不含有或候选不含有野生型SARS ‑CoV‑269‑70位点序列。 9.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于： 所述步骤C1)中， RT ‑RAA扩增的反应条件 为： 40‑44℃20‑40min。 10.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于： 所述步骤C3)中， 反应的条件为： 35 ‑39℃， 每1‑3min读取一次荧 光强度值， 读取20次以上。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114350854 A 3