(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210828523.X (22)申请日 2022.07.13 (71)申请人 黑龙江省科 学院高技 术研究院 地址 150026 黑龙江省哈尔滨市道外区南 马路135号 (72)发明人 任滨侨　宋晓晓　赵路阳　金玉　 王艳丽　杨娜　侯婉滢　张浩　 (74)专利代理 机构 北京大地智谷知识产权代理 事务所 (特殊普通合伙) 11957 专利代理师 周文谦 (51)Int.Cl. C07C 37/68(2006.01) C07C 37/72(2006.01) C07C 37/82(2006.01)C07C 39/23(2006.01) C12M 1/16(2006.01) C12M 1/04(2006.01) C12M 1/00(2006.01) (54)发明名称 一种利用真菌固态发酵提取大麻二酚的方 法 (57)摘要 本发明公开了一种真菌固态发酵提取大麻 二酚的方法， 包括如下步骤， S1： 利用蒸汽爆 破对 工业大麻花叶进行预处理； S2： 微生物和孢子悬 浮液的制备； S3： 固体培养基的配置及灭菌； S4： 微生物固态发酵大麻； S5： 发酵产物的提取和纯 化， 本发明首先通过蒸汽爆 破方法对工业大麻进 行预处理， 从而使大麻中纤维素、 半纤维素大部 分降解为可溶性小分子， 增加大麻可观表面积和 孔隙， 更有利于后续微生物发酵大麻基质； 然后 采用真菌利用气相双动态固态发酵反应器对工 业大麻进一步固态发酵， 微生物 生长代谢过程中 产生一系列酶进一步促使大麻细胞壁糖类、 蛋白 质、 纤维素等 成分的分解， 促进大麻二酚的转化， 大大提高大麻二 酚的提取率。 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 CN 115108889 A 2022.09.27 CN 115108889 A 1.一种真菌固态发酵提取 大麻二酚的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： ， S1： 利用蒸汽爆破 对工业大 麻花叶进行 预处理； 称取一定重量的大麻花叶装入汽爆罐中， 关闭阀门后通入蒸汽； 罐压升至设定的压力 和温度后， 维持一定的时间， 然后， 瞬间释放罐中的压力， 汽爆后的物料随蒸汽流进入汽爆 接收罐； 收集汽爆后的物料， 利用去离子水洗涤汽爆物料三次， 用纱布过滤， 收集固体， 然后 在烤箱中烘干并储 存在干燥处； 所述蒸汽爆破罐组件 包括： 一台蒸汽发生器、 一台反应罐和一部汽爆接收罐； S2： 微生物和孢子悬浮液的制备 准备菌种， 所述菌种包括长枝木霉、 细黄链霉菌、 链霉素链霉菌； 将试管中的菌种涂布 于土豆葡萄糖琼脂培养基培养， 用含有吐温 ‑20的无菌水洗涤平板并适当稀释获得孢子悬 浮液备用； S3： 固体培 养基的配置及灭菌 配置含80％的汽爆预处理后的大麻花叶， 并额外添加硫酸铵、 尿素、 蛋白胨作为固态发 酵氮源； 用含0.3％硫酸镁、 0.03％硫酸铁的营养液调整体系中含水量为60％； 制备的培养 基于需高压蒸汽灭菌一定时间； S4： 微生物固态发酵 大麻 待上述步骤S3中物料冷却后接入3.3 ×106/g干基的孢子， 装入气相双动态固态发酵器 进行固态发酵， 设置参数如下： 周期脉动的高压为0.2Mpa， 维持20s， 常压维持时间为20min， 发酵温度为28℃， 发酵48～72h； S5： 发酵产物的提取和纯化 将上述步骤S4中固态发酵后的物料， 转移至提取罐， 加入乙醇多次提取， 合并提取液， 真空减压浓 缩回收溶剂， 得到 工业大麻提取浸膏； 将上述工业大麻提取浸膏溶于乙醇， 离心取上清液上大孔树脂D300、 D101、 HP ‑20、 HD‑2 或C18硅胶层析柱， 流动相为乙腈和甲醇的混合溶液， 乙腈和甲醇的体积比为40： 60～20: 80， 进行分离， 收集大麻二酚馏分， 减压浓缩后得到大麻二酚纯化液， 减压干燥的到大麻二 酚成品。 2.根据权利要求1所述的一种真菌固态发酵提取大麻二酚的方法， 其特征在于， 步骤S1 中设定的压力为1.1MPa～1.5MPa， 温度为181～201℃， 维持一定的时间为3～5min， 烤箱温 度设定为5 0℃， 去离 子水的质量 为3‑4倍大麻花叶的初始质量。 3.根据权利要求1 ‑2任一项所述的一种真菌固态发酵提取大麻二酚的方法， 其特征在 于， 步骤S2 中， 将试管中的菌种涂布于土豆葡萄糖琼脂培养基中于28℃培养7天， 孢子悬浮 液浓度为107/mL。 4.根据权利要求1 ‑2任一项所述的所述的一种真菌固态发酵提取大麻二酚的方法， 其 特征在于， 步骤S3中， 制备的培 养基于121℃高压蒸汽灭菌 30min。 5.根据权利要求1 ‑2任一项所述的所述的一种真菌固态发酵提取大麻二酚的方法， 其 特征在于， 步骤S4中， 以1～2倍的体积加入乙醇,提取3～4次， 每次3～5h,提取温度30～60 ℃， 合并提取液， 真空减压浓缩回收溶剂， 得到工业大麻提取浸膏， 浸膏 得率10～25％， HPLC 检测大麻二酚含量大于 50mg/g。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115108889 A 2一种利用真 菌固态发酵提取大麻二酚的方 法 技术领域 [0001]本发明属于植物有效成分提取技术领域， 具体涉及一种利用真菌固态发酵提取工 业大麻中大麻二酚的方法。 背景技术 [0002]大麻二酚(Cannabidiol,CBD)是一种从大麻中分离得到的具有生物活性的萜类酚 类化合物， 不同于四氢大麻酚(THC)， 是非精神活性大麻素， 具有抗氧化、 抗炎、 抗菌、 神经保 护和抗惊厥等多种药理 活性， 是一种多靶点 化合物。 [0003]目前， 大麻二酚的主要提取方法包括固液萃取法(SLE)和超临界流体CO2萃取法 (SFE)。 固液萃取法往往使用大量有机溶剂， 提取的大麻产品存在溶剂残 留问题； 而超临界 流体CO2萃取法提取率高， 无溶剂残留， 但是设备投入成本高， 运行成本高， 难以工业化扩大 生产。 相较于以上方法微生物发酵提取法， 相较前两种方法， 可以大量减少有机溶剂的使 用， 工艺简单， 产品无 溶剂残留， 且运行成本较低， 适于推广应用。 [0004]微生物发酵方法主要为液态发酵法和固态发酵法。 微生物液态发酵由于整个发酵 过程中工艺参数比较容易控制， 更易工业化。 而固态发酵更像微生物的自然栖息地， 真菌生 长在干燥的基质上发展菌丝形态， 使基质穿透和气生菌丝。 相较于液态发酵， 发酵培养基更 简单， 不需要像液体发酵 罐一样多， 水的消耗 量大大减少， 整个过程更加环保。 [0005]固态发酵是以气相为连续相， 液相及其覆盖的固相为固定相的三相生物反应系 统。 其具有节能、 节水， 环境友好的特点， 在缓解液体发酵带来的废水量大、 环 境污染等瓶颈 问题具有较大潜力。 固体基质为微生物提供营养物质的同时， 还为微生物提供满足其生长 条件的空间， 因此需要对固体基质进行预处理才能获得更好的发酵效果。 固态发酵培养基 预处理的方法包括球磨、 超声等物理方法； 酸碱化学试剂降解等化学方法。 另外还有物理化 学组合方法——蒸汽爆破。 蒸汽爆破处理因效率高， 环境友好的特点被应用于木质素原料 的预处理中。 目前还未有研究报道将该 方法用于 工业大麻预处理中。 [0006]目前已有专利申请关于提取 大麻二酚的方法， 主 要包括： [0007](1)CN202010242812.2(公布日2020.07.17)， 云南西草资源开发有限公司利用紫 色硫细菌液态发酵 大麻得到纯度大于80％的大 麻二酚； [0008](2)CN201910200209.5(公布日2019.05.21)， 黑龙江阳光工业大麻研究院利用混 合真菌液态发酵 大麻得到富含CBD的浸膏 [0009](3)CN201910484684.X(公布日2019.07.23)， 云南绿新生物药业有限公司利用内 生真菌发酵床进行固体发酵， 提高大 麻二酚的提取率 [0010](4)CN 201910773152.8(公布日2019.10.29)， 李卫等利用超高压预处理汉麻， 真 菌固体发酵 得到纯度为98％的大 麻二酚固体 [0011]上述专利申请采用物理粉碎方法对物料进行预处理， 粉碎效率低， 不能使大麻细 胞壁上的纤维素和半纤维素大分子降解为可溶性小分子， 而且大麻表面积和 孔隙度较小， 不有利于真菌的生长 。说　明　书 1/6 页 3 CN 115108889 A 3