(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210943585.5 (22)申请日 2022.08.08 (71)申请人 云南农业大 学 地址 650000 云南省昆明市盘龙区金黑公 路95号 (72)发明人 梁艳丽　张晓玉　杨秋雄　张国武　 韩俊　胡于琴　赵敏　王硕　 杨和团　 (74)专利代理 机构 昆明正原 专利商标代理有限 公司 53100 专利代理师 陈左 (51)Int.Cl. G01N 1/28(2006.01) G01N 1/30(2006.01) (54)发明名称 一种太白贝 母种子石蜡切片方法 (57)摘要 本发明涉及植物领域， 特别涉及一种太白贝 母种子的石蜡切片。 本方法采用材料为重庆市巫 溪县种植的太白贝母种子， 主要步骤包括取材、 固定、 脱水、 透明、 浸蜡、 包埋、 切片、 粘片、 脱蜡、 染色、 脱水透明、 封片、 观片等。 本发明在取材、 脱 水、 透明、 浸蜡等步骤中较常规石蜡切片进行了 改良， 能够较好的固定太白贝母种子细胞组织， 切片完整， 清晰， 易于观察， 操作简单， 有利于开 展太白贝母种质资源解剖结构的观 察和研究， 为 研究太白贝母种子打破休眠的分子机制提供基 础。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 115307995 A 2022.11.08 CN 115307995 A 1.一种太白贝母种子石蜡切片方法， 其特 征在于按如下步骤进行： （1） 取材： 取饱满无缺口 的太白贝母种子作为材 料， 用流水冲洗 干净； （2） 固定： 将种子材料用吸水纸吸干表面水分， 剥去种皮， 用刀片去除种胚周围多余胚 乳， 然后迅速放入盛 有FAA固定液的容器中 固定， 4℃冰箱放置24 ‑27h； （3） 脱水： 取固定好的种子材料， 而后从低到高依次经过盛有50% →60%→70%→80%→ 90%→100%→100%系列浓度乙醇溶液的容器进行梯度脱水， 每个浓度的梯度脱水时间为 30min； （4） 透明： 采用盛有无水乙醇和二甲苯混合液的容器进行逐级透明， 无水乙醇与二甲苯 的比例依次为： 4∶ 1 →3∶2→2 ∶ 3→1∶ 4→0∶ 5→0∶ 5， 每级透明时间为6 h； （5） 浸蜡： 从种子材料透明彻底的容器中倒出1/2或2/3的二甲苯， 然后将熔点为52 ‑54 ℃的石蜡碎屑加入容器中， 一直加到二甲苯完全饱和， 容器置于混合蜡液在40℃下浸蜡 24h， 之后再用混合石蜡在温箱中60℃保温浸蜡， 每天换两次混合蜡液， 浸蜡72h； 混合蜡液 由熔点为50‑52℃和熔点 为58‑60℃的石蜡按重量比1∶ 1的比例融合而成； （6） 包埋： 种子材料浸蜡结束后马上用镊子转移到装有液态混合石蜡的纸盒中， 调整好 种子材料位置， 再将纸盒放在盛有冰水的盆中迅速冷却， 待蜡液表 面凝固后， 迅速倒扣纸盒 沉入水中， 然后让其自然漂浮于水中， 防止产生结晶； （7） 切片： 根据种子材料在蜡块中的位置和方向， 将蜡块修成梯形， 然后粘到切片机的 蜡台上进行切片得到蜡带， 控制切片厚度为6 ‑8 μm； （8） 粘片： 在洁净的载玻片上均匀薄涂一层质量体积比为2%的明胶， 将蜡带放在载玻片 上， 用蘸有水的毛笔移动蜡带以调整位置， 待蜡带展平后， 将载玻片在30 ‑35℃的水浴锅上 放置2h， 使蜡带光滑面紧贴载玻片之后再将载玻片放入38℃烘 箱中烘干 至少12h； （9） 脱蜡： 将上一步骤处理的切片依次放置于盛有纯二甲苯溶液 →二甲苯与无水乙醇1 ∶1混合溶液 →无水乙醇溶液 →90%乙醇溶液 →80%乙醇溶液 →70%乙醇溶液 →50%乙醇溶液 →30%乙醇溶 液→蒸馏水的容器中分别进行脱蜡， 在每 个容器的脱蜡时间为10mi n； （10） 染色： 脱蜡后的切片依次放置于20mg/mL的铁矾溶液中30min →5mg/mL的苏木精溶 液中30min→20mg/mL的铁矾溶 液中2min进行染色； . （11） 脱水透明： 染色后的切片依次经过盛有30% →50%→60%→70%→80%→90%→100%系 列浓度乙醇溶液的容器中进 行逐级脱 水， 每级脱水时间10 min； 后将切片依次经过无水乙醇 与二甲苯的比例分别为： 1∶ 1和0∶ 5的溶 液中进行 逐级透明， 每级透明时间10mi n； （12） 封片： 从二甲苯透明的容器中取出切片， 在二甲苯挥发完全之前， 在材料中央滴1 滴中性加拿大树胶， 将盖玻片一侧 放置在滴有树胶的组织切片上， 慢慢放下盖玻片并将空 气完全排除； 封好的切片放入40℃恒温箱中干燥过夜， 制成永久切片。 2.根据权利 要求1所述的太白贝母种子石蜡切片方法， 其特征在于： 步骤 （2） 所述的FAA 固定液组成为： 浓度38%甲醛、 冰醋酸和浓度70%乙醇， 三 者体积比为1∶ 1∶ 18。 3.根据权利要求1所述的太白贝母种子石蜡切片方法， 其特征在于： 步骤 （2） 的材料处 理去除了种胚附近多余胚乳 。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115307995 A 2一种太白贝母种子石蜡切片方 法 技术领域 [0001]本发明涉及 一种植物种子石蜡切片 方法， 特别涉及一种太白贝母种子的石蜡切片 方法。 背景技术 [0002]太白贝母( Fritillariae  cirrhosae  bulbus)为百合科(Liliaceae)贝母属 (Fritillaria )多年生草本植物， 常分布于1600m以上的高海拔地区， 其生育期极短， 仅为 100天左右， 耐严寒， 怕高温， 为典型的高山适应植物类型。 同时， 太白贝母也是大宗常用中 药材， 以干燥鳞茎入药， 被誉 为“润肺圣药”， 始载于 《神农本草经》 ,有清热润肺、 化痰止咳的 功效, 是止咳化痰良药,  以太白贝母为原料的中成药达100种以上， 以川贝枇杷膏、 川贝止 咳糖浆、 蛇 胆川贝液等止咳类药物制剂为典型代 表。 [0003]太白贝母种子对萌发条件要求较高， 具有休眠期长， 萌发率低， 发育不整齐等特 性。 大大限制了太白贝母有性生殖的成功 率， 从而导致林下天然 更新苗严重缺乏。 太白贝母 育苗技术复杂， 繁殖难度大， 特别是用种子繁殖速度非常慢。 因此， 开展对太白贝母种子休 眠与萌发的研究既具有学术 价值， 又具有一定的实际意 义。 [0004]石蜡切片是组织学研究的重要实验技术， 基本步骤包括样品的取材、 固定、 脱水、 透明、 浸蜡、 包埋、 切片、 粘片、 脱蜡、 染色和封片等一系列特殊处理。 实验步骤并不繁复， 但 要制出高质量的切片， 每一个步骤的操作都很重要， 尤其是脱 水透明阶段， 不同植物不同组 织对药品的兼容性有很大差异， 需要进行摸索和改进。 而太白贝母种胚石蜡切片技术方面 的相关研究报道很少。 [0005]综上所述， 如果能找到太白贝母种胚石蜡切片的制 备方法， 为研究太白贝母种子 休眠和萌发提供准确的技 术支持， 对揭示太白贝母种子休眠机理具有重要意 义。 发明内容 [0006]本发明的目的在于针对太白贝母种子种胚小、 胚乳成分多、 浸蜡难等原因造成种 子切片制作操作难， 观察效果不佳等问题， 提出一种太白贝母种子石蜡切片方法， 本发明的 技术方案操作简单且方便， 制作的材料切片组织结构完整、 清晰且易于观察， 有利于为研究 太白贝母种子休眠和萌发提供准确的技术支持， 对揭示太白贝母种子休眠机理具有重要意 义。 [0007]为实现上述目的， 本发明采用的技 术方案如下： 一种太白贝母种子石蜡切片方法， 按如下步骤进行： （1） 取材： 将饱满无缺口 的太白贝母种子用流水冲洗 干净； （2） 固定： 将种子用吸水纸吸干表面水分， 剥 去种皮， 去除种胚周围多余胚乳， 然后 迅速放入盛 有FAA固定液的容器中 固定， 4℃冰箱放置24 ‑27h； （3） 脱水： 取固定好的材料， 从低到高依次经过盛有50% →60%→70%→80%→90%→ 100%→100%系列浓度乙醇溶 液的容器进行 逐级脱水， 每个浓度梯度脱水时间为3 0min；说　明　书 1/4 页 3 CN 115307995 A 3