(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210898843.2 (22)申请日 2022.07.28 (71)申请人 华中农业大 学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山 街1号华中农业大 学 (72)发明人 周小云　田子楷　彭金霞　文衍红　 郭雪朋　罗福广　黄杰　王志强　 (74)专利代理 机构 北京慕达星云知识产权代理 事务所 (特殊普通合伙) 11465 专利代理师 符继超 (51)Int.Cl. G01N 1/28(2006.01) G01N 1/30(2006.01) (54)发明名称 一种环棱螺染色体的制备方法 (57)摘要 本发明公开了一种环棱螺染色体的制备方 法， 包括以下步骤： (1)打孔； (2)PHA处理； (3)秋 水仙素处理； (4)低渗； (5)固定； (6)解离； (7)制 备细胞悬液； (8)收集细胞； (9)喷片和染色。 本发 明公开的高效制备环棱螺染色体标本的方法， 是 在螺壳的适宜位置打小孔， 通过小孔将药物注射 到螺体内， 用石蜡封住小孔， 保证药物与靶组织 充分接触， 从而大幅度提高中期分裂相的得率； 并且在药物处理组织的过程中， 螺始终处于活体 状态， 细胞分裂旺盛。 该方法得到的分裂相多、 染 色体收缩适中、 分散 状态良好， 并且结果稳定 。 权利要求书1页 说明书6页 附图2页 CN 115266266 A 2022.11.01 CN 115266266 A 1.一种环棱螺染色体的制备 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)打孔： 用电钻在第一螺层打一小孔； (2)PHA处 理： 用注射器将PHA通过小孔注射到 螺体内， 然后用石蜡封住小孔16 ‑20h； (3)秋水仙素处理： 去掉封口石蜡， 用注射器将秋水仙素通过小孔注射到螺体内， 用石 蜡封住小孔2 ～4h； (4)低渗： 解剖螺体， 取早期胚胎和鳃组织， 置 于10mL KCI溶液中低渗处 理； (5)固定： 弃去低渗液， 用10mL新配置的固定液固定胚胎和鳃组织40～60min， 然后重复 固定一次； (6)解离： 弃去步骤(5)的固定液， 加入10mL预冷的冰醋酸， 解离组织15～ 20min； (7)制备细胞悬液： 对冰醋酸解离过的胚胎， 研磨过筛， 用5mL固定液冲下细胞， 然后将 所得细胞转移至10 mL离心管中； 对冰醋酸处理过的鳃组织， 夹住 鳃丝， 在5 ml固定液中摆动3 ～5次， 将得到的细胞 连同固定液转移至另一个10mL离心管中； (8)收集细胞： 将步骤(7)中装有胚胎和鳃细胞悬液的离心管在1000r/min下离心 10min， 弃去上清液； (9)喷片和染色： 在离心管中加入0.5mL新配制的固定液， 吹散细 胞， 取细胞悬液喷到预 冷的载玻片上， 自然干燥， Giem sa染色， 即得到环棱螺染色体。 2.根据权利要求1所述一种环棱螺染色体的制备方法， 其特征在于， 所述固定液由甲醇 与冰醋酸按3:1的体积比配制得到 。 3.根据权利要求1所述一种环棱螺染色体的制备方法， 其特征在于， 步骤(1)中小孔的 位置为螺厣片侧、 第一螺层中上部 。 4.根据权利要求3所述一种环棱螺染色体的制备方法， 其特征在于， 步骤(1)中所述小 孔的直径为0.1～0.2cm。 5.根据权利 要求1所述一种环棱螺染色体的制备方法， 其特征在于， 步骤(2)中所述PHA 的注射量为6～10 μg/g环棱螺体重 。 6.根据权利要求1所述一种环棱螺染色体的制备方法， 其特征在于， 步骤(3)中所述秋 水仙素的注射 量为3～6 μg/g螺环棱体重 。 7.根据权利 要求1所述一种环棱螺染色体的制备方法， 其特征在于， 步骤(4)中所述KCI 溶液的质量分数为0.3％； 所述低渗处 理的温度为室温， 低渗处 理时间为 40‑60min。 8.根据权利要求1所述一种环棱螺染色体的制备方法， 其特征在于， 步骤(6)中所述预 冷的冰醋酸 为用ddH2O配制45％的冰醋酸， 置 于冰水混合物中预冷3 0min得到。 9.根据权利要求1所述一种环棱螺染色体的制备方法， 其特征在于， 步骤(7)中所述研 磨过筛的筛网 网目为40～60目。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115266266 A 2一种环棱螺染色体的制备方 法 技术领域 [0001]本发明涉及动物细胞学实验技术领域， 具体涉及 一种高效制备环棱螺染色体标本 的方法。 背景技术 [0002]环棱螺主要包括梨形环棱螺、 铜锈环棱螺和角形环棱螺等， 在广西地区统称为 “螺 蛳”。 以螺蛳肉为核心原料的 “柳州螺蛳粉 ”是广西著名特色小吃， 深受国内外消费者的青 睐。 近年来， 随着螺蛳粉产业的快速发展， 环棱螺的规模化养殖也得以迅速普及。 环棱螺养 殖业的健康稳定发展凾需环棱螺遗传学研究和育种工作的开展。 染色体制备是细胞遗传学 研究的一项基本技术， 是倍性检测、 杂种鉴定、 染色体基因定位等遗传育种工作的基础， 其 对近缘物种的鉴定、 系统演化研究等也有重要意义。 因此， 快速、 稳定地制备出收缩适中、 形 态清晰、 分散良好的染色体标本非常重要。 [0003]周暾等在“田螺科五种螺的核型研究 ”(动物学报,1988,364 ‑370)中报道了环棱螺 和田螺的染色体标本制备方法， 其是将早期胚胎从雌螺体内取出， 剥膜后置于氯化钠+葡萄 糖的溶液中， 用秋水仙素处理， 制备染色体标本， 但在实际操作中， 早期胚胎剥膜后很容易 死亡， 导致染色体标本制作成功率低、 结果不稳定。 王兰和赵赓在 “铜锈环棱螺的染色体组 型研究”(山西大学学报(自然科学版),1990,227 ‑229)中， 将雄螺直接置于秋水仙素中处 理， 然后取雄性性腺制备染色体标本， 该方法也存在两方面的问题， 一是其只针对性成熟的 雄螺， 而性未成熟 的雄螺、 以及雌螺则不能用该方法， 使得其应用受到限制； 二是环棱螺受 到刺激后， 会产生应激反应， 内脏团缩回壳内、 并用厣片封住壳口， 这使得药物很难与靶组 织充分接触， 导致在实际操作中能获得的分裂相很少、 制片效果不理想。 叶冰莹等在 “大瓶 螺(Ampullaria  gigas Spix)的核型分析 ”(福建师范大学学报(自然科学版),199 5,11:95‑ 99)中， 由螺的厣向腹腔注 射HCG和秋水仙素， 然后取鳃和性腺制备染色体标本， 但在实际操 作中， 触碰螺体后， 其内脏团迅速缩回壳内、 同时用角质厣片封住壳口， 并且靠近厣的部位 是大块紧张收缩的腹足， 因此， 通过厣向腹腔注射药物的操作比较困难； 此外， 即便强行将 药物注射到腹足肌肉中， 药物也很难与靶组织充分接触。 [0004]目前已经报道的环棱螺染色体标本制备主要包括三类方法： 一是将早期胚胎从雌 螺体内取出， 剥 膜后置于秋水仙素溶液中处理； 二是直接将螺置于秋水仙素中处理， 然后取 组织制备染色体标本； 三是由螺的厣向腹腔注 射HCG和秋水仙素， 然后取组织制备染色体标 本。 在实际操作中， 早期胚胎剥膜后很容易死亡， 这导致染色体标本制作成功率低； 将螺直 接置于秋水仙素中处理， 或者由厣向腹腔注射药物， 也存在实际操作困难： 螺受刺激后， 其 内脏团迅速缩回壳内、 并用厣片 封住壳口， 而靠近厣的部位是大块紧张收缩的腹足， 药物很 难与靶组织充分接触。 上述问题导致现有的染色体制备方法成功 率低、 分裂相少、 制片效果 不理想。 [0005]因此， 提供一种成功率高、 分裂相多且制片效果好的高效制 备环棱螺染色体标本 的方法是本领域 技术人员亟需解决的技 术问题。说　明　书 1/6 页 3 CN 115266266 A 3