ICS 65.020.30 B40/49 重 DB50 庆 市 地 方 标 准 DB 50/T 1044—2020 无菌（Germ-free,GF）猪微生物学监测技术 规范 Technical Specification for Microbiological Monitoring of Germ-free Pig 2020-10-10 发布 2020-12-30 实施 重庆市市场监督管理局 发 布 DB50/T 1044—2020 目 前 次 言................................................................................................................................................................... 2 1 范围................................................................................................................................................................... 3 2 规范性引用文件............................................................................................................................................... 3 3 术语和定义....................................................................................................................................................... 3 4 妊娠母猪微生物学监测................................................................................................................................... 4 5 无菌猪微生物学监测....................................................................................................................................... 4 6 饮水和日粮微生物学监测............................................................................................................................... 6 7 隔离器和物品微生物学监测........................................................................................................................... 7 1 DB50/T 1044—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则编写。 本标准由重庆市畜牧科学院提出。 本标准由重庆市农业农村委员会归口。 本标准主要起草单位：重庆市畜牧科学院。 本标准主要起草人：葛良鹏、孙静、梁浩、刘作华、丁玉春、吴梦、黄勇。 2 DB50/T 1044—2020 无菌（Germ-free, GF）猪微生物学监测技术规范 1 范围 本标准规定了无菌猪生产及使用过程中的妊娠母猪、无菌猪、饮水和日粮、隔离器和物品等微生物 学监测技术要求。 本标准适用于无菌猪生产和使用时微生物学质量控制。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 16551 猪瘟检疫技术规范 GB/T 18090-2008 猪繁殖与呼吸综合诊断方法 GB/T 18448.1-2001 实验动物体外寄生虫检测方法 GB/T 18448.2-2008 实验动物弓形虫检测方法 GB/T 18641 伪狂犬病诊断技术 GB/T 18935-2003 口蹄疫诊断技术 GB/T 21674-2008 猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法 SN/T 1559-2010 非洲猪瘟检疫技术规范 SN/T 1919-2016 猪细小病毒病检疫技术规范 NY/T 544-2015 猪流行性腹泻诊断技术 NY/T 548-2015 猪传染性胃肠炎诊断技术 NY/T 678 猪伪狂犬病免疫酶试验方法 NY/T 679 猪繁殖与呼吸综合症免疫酶试验方法 3 术语和定义 下列术语与定义适用于本文件。 3.1 无菌猪 Germ-free (GF) pig 利用现有检测手段，无可检出一切活的微生物（包括细菌、病毒）和寄生虫，能保证猪源性细胞、 组织、器官研究的生物安全性和清晰的微生物背景的实验用猪，简称无菌猪。 3.2 悉生猪 Gnotobitoic (GN) pig 以无菌猪为对象，通过微生物移植技术构建出只含有特定菌群，并始终在可屏蔽外界微生物条件下 生活的实验用猪，可分为单一菌株移植悉生猪和组合菌群移植悉生猪。 3 DB50/T 1044—2020 3.3 隔离环境 Isolation environment 与外界完全隔离，可阻断任何外源微生物侵入的封闭空间。 3.4 屏障环境 Barrier environment 屏障环境应作为隔离环境的第一层保障，用于放置和使用无菌隔离器。 4 妊娠母猪微生物学监测 妊娠猪应未注射猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗，外观健康、无异常；应排除经胎盘垂直传播的四种 疾病，包括猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病、猪细小病毒病。病原筛查方法参照 GB/T16551、 GB/T18641、NY/T679 和 SN/T 1919-2016 执行。 5 5.1 无菌猪微生物学监测 采样 5.1.1 采样管的准备 宜采用螺帽盖的采样管，内部自带 1 支拭子。也可通过带螺帽盖的离心管和 1 支棉签自制而成。采 样管选择在保质期内的、且包装完好的无菌采样管（宜经过环氧乙烷灭菌处理），或提前高温高压灭菌 处理。采样当天，无菌采样管放入屏障设施的传递窗内，并紫外光照 30min 及以上。 5.1.2 采样管转入隔离器 在保持无菌猪饲养隔离器传递通道内部密封罩密封状态下，取下传递通道外侧密封罩，将无菌采样 管放入传递通道，密封外侧密封罩。采用 1.5%-2%新制的过氧乙酸从传递通道外侧密封罩上的消毒孔， 对传递通道内部空间进行喷雾消毒。喷雾时间不宜低于 5min。密封消毒孔，并等待 30min 以上。通过 无菌猪饲养隔离器操作手套，从隔离器内部取下传递通道内侧密封罩，将无菌采样管移入隔离器内，重 新罩上传递通道的内侧密封罩。 5.1.3 采样过程 根据实验要求用拭子采集样本（如猪肛门拭子、鼻拭子或新鲜粪便），立即装回采样管，并盖紧螺 帽盖。 5.1.4 采样管转出隔离器 取下传递通道内部密封罩，将采样管转到隔离器的传递通道内部，罩好内部密封罩，再打开隔离器 传递通道的外部密封罩，将采样管取出，重新罩上外部密封罩。采用 1.5%-2%新制的过氧乙酸从传递通 道外部密封罩上的消毒孔，对传递通道内部空间进行喷雾。喷雾时间宜不少于 5min。 5.2 细菌监测 4 DB50/T 1044—2020 5.2.1 培养及观察 将采集的样本分别接种于血琼脂培养基、脑心浸液肉汤和硫乙醇酸盐培养基，分别在需氧和厌氧条 件下 37℃培养 48h 及以上。无菌条件下，取培养后的样本，涂片、固定、革兰染色后显微镜下检查菌 体及形态。每个隔离器，宜平行检测重复 3 次。 5.2.2 判定标准 固体培养基上，应无任何可见菌落；液体培养基内，应无浑浊、无沉淀，且镜检无细菌菌体。 5.2.3 监测频率 宜每周检测 1 次。 5.3 真菌监测 5.3.1 培养及观察 将采集的样本接种于大豆酪蛋白固体培养基，分别在 20℃、28℃和 37℃下需氧培养 48h 及以上。 每个隔离器，宜平行检测重复 3 次。 5.3.2 判定标准 固体培养基上，应无任何可见菌落，且镜检无真菌菌体。 5.3.3 监测频率 宜每周检测 1 次。 5.4 无菌猪病毒监测 5.4.1 监测指标 应对 4 种垂直传播病毒进行监测，包括猪瘟病毒、细小病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合 征病毒。应对 5 种猪常见病毒进行监测，包括口蹄疫病毒 O、猪圆环-2 型病毒、猪流行性腹泻病毒、猪 传染性胃肠炎病毒、非洲猪瘟病毒。 5.4.2 指标检测标准 无菌猪的 9 种病毒指标及其检测标准见表 1。 表 1 9 种病毒指标及检测标准 病毒指标 检测标准 猪瘟病毒 GB/T 16551-2008 猪繁殖与呼吸综合征病毒按照 GB/T 18090-2008 猪细小病病毒 SN/T 1919-2016 5 DB50/T 1044—2020 猪伪狂犬病病毒 NY/T 678-2003 猪圆环-2 型病毒 GB/T 21674-2008 猪口蹄疫病毒 O GB/T 18935-2003 猪流行性腹泻病毒 NY/T 544-2015 猪传染性胃肠炎病毒 NY/T 548-2015 非洲猪瘟病毒 SN/T 1559-2010 5.4.3 判定标准 上述 9 种病毒不应检出。 5.4.4 监测频率 宜每月检测 1 次。 5.5 无菌猪寄生虫监测 5.5.1 监测指标 对猪弓形虫、猪血虱、猪疥螨 3 种猪寄生虫指标进行监测。 5.5.2 指标检测方法 猪弓形虫检测按照 GB/T 18448.2-2001 执行，猪血虱、猪疥螨按照 GB/T 18448.1-2001 执行。 5.5.3 判定标准 不应检出任何寄生虫。 5.5.4 监测频率 宜每周检测 1 次。 6 饮水和日粮微生物学监测 6.1 饮水微生物学监测 6.1.1 采样与培养 无菌条件下，取冷却的灭菌纯水 1mL，接种到大豆酪蛋白固体培养基，分别在 28℃和 37℃需氧培 养 24h。宜平行检测重复 3 次。 6 D