(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210869251.8 (22)申请日 2022.07.22 (71)申请人 上海中医药大学 地址 201203 上海市浦东 新区蔡伦路120 0 号 (72)发明人 王顺春　王辉俊　刘睿敏　施松善　 鲍斌　赵咏麟　邱宝玉　 (74)专利代理 机构 北京乾成律师事务所 1 1949 专利代理师 郑希元 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/30(2006.01) G01N 30/32(2006.01) G01N 30/34(2006.01)G01N 30/86(2006.01) (54)发明名称 一种枸杞子的质量控制方法及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种 枸杞子的质量控制方法， 该方法包括以下步骤： (1)使用光谱 ‑效应关系的 统计方法对枸杞子寡糖HPLC指纹图谱的特征峰 与抗肿瘤活性的关联度进行关联分析； (2)根据 分析结果， 获得可作为枸杞子质量控制的质量标 志物； 以及(3)根据该质量标志物制订该枸杞子 的质量控制标准。 该方法进一步揭示枸杞子中与 抗肿瘤活性有关的关键成分， 为枸杞子整体质量 评价提供新的参 考依据。 权利要求书3页 说明书15页 附图8页 CN 115201378 A 2022.10.18 CN 115201378 A 1.一种枸杞子的质量控制方法， 其特 征在于， 所述方法包括以下步骤： (1)使用光谱 ‑效应关系的统计方法对枸杞子寡糖HPLC指纹图谱的特征峰与抗肿瘤活 性的关联度进行关联分析； (2)根据分析 结果， 获得 可作为枸杞子质量控制的质量标志 物； 以及 (3)根据所述质量标志 物制订所述枸杞子的质量控制标准。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述光谱 ‑效应关系的统计方法选自以下 的一种或多种： 相关分析、 主成分分析、 典型相关分析、 多 元线性回归、 偏最小二乘回归和灰 度关联分析； 优选地， 所述 光谱‑效应关系的统计方法为灰度关联分析。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述枸杞子为柱筒枸杞、 柔茎枸杞、 黑果枸 杞、 截萼枸杞和/或宁夏枸杞的干燥成熟果实； 优选地， 所述枸杞子的产地 为宁夏、 甘肃、 内蒙古、 新疆和/或青海； 更优选地， 所述枸杞子为宁夏枸杞的干燥成熟果实。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述枸杞子寡糖由2～10个单糖单元通过 糖苷键结合而成； 优选地， 所述枸杞子 寡糖由2～6个单糖单 元通过糖苷键结合而成； 更优选地， 所述枸杞子 寡糖由葡萄糖、 甘露糖和/或半乳糖通过糖苷键结合而成； 又优选地， 所述枸杞子寡糖选自以下的一种或多种： 蔗糖、 蜜二糖、 棉子糖、 蔗果三糖、 蔗果四糖、 蔗果五糖和蔗果六糖。 5.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述质量标志物选自以下的一种或多种： 蔗果四糖、 蔗果五糖和蔗果六糖。 6.根据权利要求1所述的方法， 其特 征在于， 所述关联分析包括以下步骤： (a)确定分析序列； (b)对所述分析序列的数据进行 无量纲化处 理； (c)计算各个所述分析序列对应的关联系数； 以及 (d)计算灰色 关联度。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述分析序列包括参考序列和比较序列， 其中不同批次枸杞子寡糖对HepG2细胞活力抑制率作为参考序列， 记为X0(k)， 不同批次枸 杞子寡糖特征图谱共有峰的峰面积作为比较序列， 记为Xi(k)； 优选地， 采用归一 化法按照以下公式 对所述分析序列的数据进行 无量纲化处 理， 更优选地， 按照以下公式分别计算各个所述比较序列和所述参考序列对应的关联系 数， 权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115201378 A 2其中k为枸杞子寡糖提取物的批次数， Xi为不同批次枸杞子寡糖对HepG2细胞活力抑制 率， ξi为第k个批次枸杞子寡糖比较序列与参考序列的关联系数， 为两级 最小差值， 为两级最大差值， ρ 为分辨系数， 取值范围0＜ρ＜1， 优选地ρ ＝0.5； 又优选地， 灰色关联度为所述关联系数的算数平均数， 按照以下公式进行计算得到枸 杞子寡糖各色谱特 征峰与抑制HepG2细胞活力作用之间的灰色 关联度γi， 其中γi为所述参考序列与所述比较序列之间的关联度， N 为所述比较序列的数据个数。 8.一种枸杞子 寡糖HPLC指纹图谱的构建方法， 其特 征在于， 所述方法包括以下步骤： 枸杞子寡糖样品溶液的制备： (a)称取适量的枸杞子样品置于容器中， 加入水加热回 流， 冷却后过滤， 滤液合并至100mL容量瓶中， 加适量水定容至刻度线， 上下颠倒摇匀， 得到 供试品溶液； (b)取石墨化碳SPE小柱， 依次用水、 甲醇、 水各5mL进行冲洗活化， 得到活化处 理后的石墨化碳SPE小柱； 以及(c)将所述供试品溶液以枸杞子药材的质量计配成100mg/mL 水溶液， 充分溶解并涡旋混匀后离心， 吸取上清液1mL， 上样于所述活化处理后的石墨化碳 SPE小柱， 先用5mL蒸馏水洗脱， 再用5mL  50％甲醇溶液洗脱， 50％甲醇洗脱液用氮吹吹干， 干燥样品加0.2mL水 溶解后离心， 取 上清液， 得到所述枸杞子 寡糖样品溶 液； 对照品溶液的制备： 称取蔗糖、 蜜二糖、 棉子糖、 蔗果三糖、 蔗果四糖、 蔗果五糖和蔗果 六糖， 加水制成含各成分浓度为0.1～4.2mg/mL的所述对照品溶 液； 高效液相检测的色谱条件为： 采用Prevail  Carbohydrate  ES(250×4.6mm， 5 μm)色谱 柱， 以甲醇或乙腈为流动相A、 酸水溶液、 碱水溶液和/或缓冲盐水溶液为流动相B， 梯度洗脱 程序为： 0～ 10min， 85％～80 ％A； 10～30min， 80％～77％A； 30～40min， 77％～77％A； 40～ 65min， 77％～60％A； 65～80min， 60％A； 流速为0.8～1.2mL/min； 柱温为40～50℃； 检测器 为HPLC‑CAD检测器； 根据高效液相检测结果， 获得枸杞子 寡糖HPLC指纹图谱； 优选地， 所述高效液相检测的流速为约1.0mL/mi n， 柱温为约45℃； 更优选地， 所述指纹图谱包括1 ‑22号峰， 其中， 1号峰为蔗糖作为参照峰、 5号峰为蜜二 糖、 10号峰为棉子糖、 11号峰为蔗果三糖、 14号峰为蔗果四糖、 20号峰为蔗果五糖、 21号峰为 蔗果六糖； 又优选地， 所述酸水溶液、 碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的甲酸、 冰乙酸、 磷酸、 三氟乙酸、 甲酸和甲酸铵、 乙酸和乙酸钠、 乙酸和乙酸铵、 磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、 磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、 磷酸氢二钠和柠檬酸、 柠檬酸和柠檬酸钠、 甘氨酸和盐酸、 或者 邻苯二甲酸和盐酸； 特别优选地， 所述流动相B为25～35mM甲酸铵(+0.2％～+0.4％甲酸)水溶液， 例如约 30mM甲酸铵(+约0.3％甲酸)水 溶液； 最优选地， 以色谱峰1号为参照峰， 2 ‑22号峰的相对保留时间分别为1.105～1.115、 1.175～1.185、 1.26～1.27、 1.3～1.31、 1.335～1.345、 1.37～1.38、 1.49～1.5、 1.55～ 1.56、 1.58～1.59、 1.65～1.66、 1.84～1.85、 1.875～1.885、 2.02～2.03、 2.12～2.13、 2.13权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 115201378 A 3