(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210953060.X (22)申请日 2022.08.10 (71)申请人 无锡生基医药 科技有限公司 地址 214174 江苏省无锡市惠山经济开发 区惠山大道1719- 6号一层A区 (72)发明人 雷静　陆明雯　蒋鑫　王沁瑜　 周园　程志茹　徐刚明　郑艳军　 陈琪　 (74)专利代理 机构 上海市汇业 律师事务所 31325 专利代理师 王函 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/04(2006.01) G01N 30/06(2006.01)G01N 30/74(2006.01) G01N 30/86(2006.01) G01N 30/38(2006.01) (54)发明名称 一种检测Trito n X-100残留的方法 (57)摘要 本发明公开了一种检测Triton  X‑100残留 的方法， 所述方法基于HPLC技术， 采用乙腈 ‑水为 HPLC的流动相， 用孔径为 粒径为3.5μm的 SB‑C18色谱柱分离和检测Triton  X‑100残留。 本 发明方法结果准确、 重复性好， 线性范围为2.5 ‑ 80μg/mL， Triton  X‑100残留的检测不受聚乙烯 亚胺、 Pluro nic F‑68等大分子物质干 扰。 权利要求书1页 说明书7页 附图5页 CN 115236240 A 2022.10.25 CN 115236240 A 1.一种检测Trito n X‑100残留的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 1).将Triton  X‑100标准品用水溶解后配制成浓度为2.5、 5.0、 10.0、 20.0、 40.0、 60.0 和80.0 μg/mL的标准溶 液； 2).用乙腈 ‑水为流动相， 平衡色谱柱； 3).取所述标准溶液与乙醇混合， 涡旋震荡混匀， 离心， 上清液转移至HPLC管中； 以水或 样品缓冲液为阴性对照； 4).上样所述上清液， 使用SB ‑C18色谱柱， 其孔径为 粒径3.5 μm， 以乙腈 ‑水梯度为 流动相， 分离检测Trito n X‑100， 检测在280nm处的光吸 收值； 5).以峰面积为纵坐标， Triton  X‑100标准品浓度为横坐标， 建立Triton  X‑100标准曲 线， 计算样品中Trito n X‑100残留量。 2.根据权利要求1所述一种检测Triton  X‑100残留的方法， 其特征在于， 步骤2)中， 所 述流动相乙腈 ‑水中乙腈溶 液的体积浓度为 40～60％。 3.根据权利要求1或2所述一种检测Triton  X‑100残留的方法， 其特征在于， 步骤3)中， 所述标准溶 液︰ 所述乙醇的体积比为1︰ 1.8～ 2.5。 4.根据权利要求1或2所述一种检测Triton  X‑100残留的方法， 其特征在于， 步骤3)中， 所述离心的转速为大于或等于18,0 00g， 时间为至少5mi n。 5.根据权利要求1或2所述一种检测Triton  X‑100残留的方法， 其特征在于， 步骤3)中， 所用色谱柱为Agilent  ZORBAX SB‑C18， 其孔径为 填料的粒径为3.5 μm， 规格为4.6 × 150mm。 6.根据权利要求1或2所述一种检测Triton  X‑100残留的方法， 其特征在于， 步骤4)中， 所述流动相乙腈 ‑水中， 流动相A为 40～60％乙腈溶 液； 流动相B为80 ‑100％乙腈溶 液。 7.根据权利要求1或2所述一种检测Triton  X‑100残留的方法， 其特征在于， 步骤4)中， 所述流动相的流速为0.5～1mL/mi n。 8.根据权利要求1或2所述一种检测Triton  X‑100残留的方法， 其特征在于， 步骤4)中， 所述上样量 为50 μL。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115236240 A 2一种检测Triton  X‑100残留的方法 技术领域 [0001]本发明涉及一种检测方法， 具体涉及一种基于HPLC技术检测Triton  X‑100残留的 方法。 背景技术 [0002]根据市场调 研机构Fortune  Business  Insights发布的报告， 2019年基因治疗市 场规模为36.1亿美元， 预计到2027年将达到356.7亿美元， 预测期内的年均复合增长率 (CAGR)为33 .6％。 目前， 基因药物的病毒类载体主要是腺相关病毒(Adeno ‑ AssociatedVirus， 缩略为A AV)和腺病毒(Aden ovirus)两大类。 [0003]2012年11月2日， 以1型AAV为载体表达脂蛋白脂酶的药物Glybera被欧盟正式批准 上市， 递送表达编码脂蛋 白脂肪酶(lipoprteinlipase)的转基因， 用于治疗LPL缺失患者， 但后来于2017年退市。 2017年12月20日， 美国Spark  Therapeutics公司开发的Luxturna获 美国食品药物监督管理局(Food  and Drug Administration,缩 略为FDA)批准， 用于治疗 Leber先天性黑蒙2型(Leber ’s Congenital  Amaurosis  2,缩略为LCA2)， 由于RPE65 (Retinal Pigment Epithelium‑specific  65kDa Protein， 缩略为RPE65)基因突变而 导致 失明的患者。 它使用AAV2平台来递送 正常RPE65基因， 采用在视网膜下腔直接注射的方法将 病毒导入眼球中。 这是美国第一个利用AAV作为载体， 体内直接用药， 用于治疗 “基因缺失遗 传病”的基因治疗药物。 2019年5月24日， 美国FDA批准Novartis公司AveXis  Inc.开发的基 因治疗产品Zolgensma， 应用AAV9介导表达运动神经元存活蛋白SMN1(Survival  Motor  Neuron Gene 1， 缩略为SMN1)， 用于治疗SMN1缺失的脊髓性肌 萎缩症的婴儿患者。 [0004]这些基因治疗的成功， 激发了重组腺相关病毒(recombinant  Adeno‑Associated   Virus， 缩略为r AAV)基因药物的研发热潮。 [0005]AAV是一种隶属细小病毒科(Parvoviridae)， 无包膜的单链线状DNA病毒， 外形为 裸露的20面体颗粒， 大小为20～26nm。 AAV不能独立复制， 只有在辅助病毒(如腺病毒、 单纯 疱疹病毒、 痘苗病毒)存在时， 才能进行复制。 AAV病毒的基因组约4700bp， 包括上下游两个 开放读码框架(Open  Reading Frame,缩略为ORF)， 位于分别由145个核苷酸组成的2 个反向 末端重复序列(Inverte d Terminal  Repeat， 缩略为ITR)之间。 在两个ITR之间编码两个 蛋 白： Cap和Rep。 其中Rep基因参与病毒的复制和整合， Cap基因编码病毒衣壳 蛋白。 [0006]rAAV病毒基因治疗制品的适应症主要集中在单基因遗传病领域,包括血友病、 杜 氏肌营养不良症、 先天性黑蒙症、 脂蛋白脂酶缺乏症和阿尔茨海默症等。 与传统的替代疗法 相比[8],rAAV制品在基因层面进行修复,单次给 药即有可能达 到长期疗效。 [0007]根据衣壳蛋白的不同,AAV病毒可分为12种血清型和100多种变体。 不同血清型对 人体不同组织的靶向性和感染效率存在差异,如AAV8对肝脏组织细胞感染效率较高,AAV1 和AAV9则分别对心脏细胞和骨骼肌细胞更为敏感。 rAAV病毒 载体对于骨骼肌、 视网膜、 肝细 胞、 心脏平 滑肌细胞、 神经 元细胞、 胰岛B 细胞、 关节 滑膜细胞等具有良好的感染效果。 [0008]rAAV病毒是安全级别最高的基因治疗载体。 rAAV病毒源于 非致病的野生型腺相关说　明　书 1/7 页 3 CN 115236240 A 3