(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210946553.0 (22)申请日 2022.08.08 (71)申请人 江苏格诺生物科技有限公司 地址 226009 江苏省南 通市开发区新 东路9 号 (72)发明人 孙纯朴　薛良　马嘉欣　 (74)专利代理 机构 深圳博敖专利代理事务所 (普通合伙) 44884 专利代理师 杨洋 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/72(2006.01) (54)发明名称 一种检测人全血中多种免疫抑制剂药物的 预处理试剂盒及其使用方法 (57)摘要 本发明公开一种检测人全血中多种免疫抑 制剂药物的预处理试剂盒， 应用于人全血样本中 环孢霉素A、 他克莫司、 依维莫司、 雷帕霉素等多 种免疫抑制剂药物的释放， 便于后续的LC ‑MS/MS 的检测， 本试剂盒包括有A液和C液， 其中： A液中 包括有用于破碎全血样本中的红细胞， 释放目标 化合物， 同时重金属盐能使蛋白质变性的硫酸 锌， C液中包括有用于上清液复溶， 减少溶剂效应 的甲醇。 本发 明中的硫酸锌能破碎全 血样本中的 红细胞， 释放目标化合物， 同时重金属盐能使蛋 白质变性， 该试剂能够比较安全有效地使蛋白质 析出沉淀， 相比固相萃取法处理全血更简便， 处 理后的上清液加入甲醇复溶， 能有效减少溶剂效 应， 缩短检测时间， 有效提高检测通 量。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 115308328 A 2022.11.08 CN 115308328 A 1.一种检测人全血中多种免疫抑制 剂药物的预处理试剂 盒， 本预处理试剂盒应用于人 全血样本中环孢霉素A、 他克莫司、 依维莫司、 雷帕霉素等多种免疫抑制剂药物的释放， 便于 后续的LC ‑MS/MS的检测， 其特 征在于： 本试剂盒包括有A液和C液， 其中： A液中包括有用于破碎全血样本 中的红细胞， 释放目标化合物， 同时重金属盐能使蛋白 质变性的硫酸锌； C液中包括有用于上清液复溶， 减少溶剂效应的 甲醇。 2.根据权利要求1所述的检测人全血中多种免疫抑制剂药物的预处理试剂盒的使用方 法， 其特征在于： 本方法包括以下步骤： S1、 一次振 荡混匀； S2、 离心处理； S3、 加入C液； S4、 二 次振荡， 其中： S1、 一次振荡混匀： 量取定量的免疫抑制剂标线1～8、 质控和内标储备液， 精密吸取全 血样品或标线或质控40 ‑45 μL到1.5mL离心管中， 加入180 ‑220 μL A液和380 ‑420 μL内标工作 液， 室温振荡5分钟， 转速为10 00‑1100rpm； S2、 离心处理： 将步骤S1中振荡后的混合物放置到离心设备中进行离心， 其中： 离心温 度为4℃‑7℃， 转速为10 00‑1400rpm； S3、 加入C液： 吸取步骤S2中离心后混合液的上清液90 ‑120 μL于96孔板， 加入 100‑110 μL  C液； S4、 二次振荡： 将步骤S3中加入C液的混合液振荡5分钟转速为10 00‑1100rpm。 3.根据权利要求2所述的检测人全血中多种免疫抑制剂药物的预处理试剂盒的使用方 法， 其特征在于： 本方法步骤S1中量取的免疫抑制剂标线1～8、 质控和内标储备液需先进 行 恢复至室温， 振荡混匀处 理。 4.根据权利要求2所述的检测人全血中多种免疫抑制剂药物的预处理试剂盒的使用方 法， 其特征在于： 本方法步骤S1中的内标工作液由内标储 存液经用甲醇稀释制得。 5.根据权利要求2所述的检测人全血中多种免疫抑制剂药物的预处理试剂盒的使用方 法， 其特征在于： 本方法步骤S1中加入180 ‑220 μL A液和380 ‑420 μL内标工作液后先经过手 动摇匀， 超声 波震动处理30秒， 再进行振荡处 理。 6.根据权利要求2所述的检测人全血中多种免疫抑制剂药物的预处理试剂盒及的用方 法， 其特征在于： 本方法步骤S1和S4中振荡处 理均采用旋涡振荡器旋涡振荡。 7.根据权利要求2所述的检测人全血中多种免疫抑制剂药物的预处理试剂盒的使用方 法， 其特征在于： 本方法S4中振荡完成后上机采用LC ‑MS方法进行检测。 8.根据权利要求1所述的检测人全血中多种免疫抑制剂药物的预处理试剂盒， 其特征 在于： 所述A液和C液均采用不透光的玻璃瓶进行封装。 9.根据权利要求2所述的检测人全血中多种免疫抑制剂药物的预处理试剂盒， 其特征 在于： 所述标准曲线C1～C8为环孢霉素A线性范围为： 10～1000ng/mL， 依维莫司线性范围 为： 2～200ng/mL， 他克 莫司线性范围为： 2 ～200ng/mL， 西罗莫司线性范围为： 2 ～200ng/mL； 所述质控品LQC、 MQC、 HQC为环孢霉素A的浓度为： 20、 400、 800ng/mL， 依维莫司的浓度 为： 4、 80、 160ng/mL， 他克莫司的浓度为： 4、 80、 160ng/mL， 西罗莫司的浓度为： 4、 80、 160ng/ mL； 所述内标工作液浓度 为环孢霉素A内标浓度为： 200n g/mL， 依维莫司内标浓度为： 20ng/ mL， 他克莫司内标浓度为： 20ng/mL， 西罗莫司内标浓度为： 20ng/mL。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115308328 A 2一种检测人全 血中多种免疫抑制剂药物的预处理试剂盒及其 使用方法 技术领域 [0001]本发明涉及 微量化合物检测技术领域， 具体为一种检测人全血中多种免疫抑制剂 药物的预处 理试剂盒及其使用方法。 背景技术 [0002]免疫抑制剂药物是一类通过抑制细胞及体液免疫反应， 从而使组织损伤得以减轻 的生物或化学物质， 目前， 广泛应用于器官移植 抗排斥反应和自身免疫性疾病的治疗。 [0003]现有技术的不足： [0004]目前， 市面上各种基于化学发光法的免疫抑制剂药物检测试剂盒， 多是直接检测 人全血中的免疫抑制剂药物含量， 但受 限于方法学 的灵敏度和特异性， 致使检测结果不能 精确地反映人全血中的免疫抑制剂药物含量， 不能为临床诊断提供 更加有效的信息 。 发明内容 [0005]本发明的目的在于提供一种检测人全血中多种免疫抑制剂药物的预处理试剂盒 及其使用方法， 以解决上述背景技 术中提出的问题。 [0006]一种检测人全血中多种免疫抑制剂药物的预处理试剂盒， 本预处理试剂盒应用于 人全血样本中环孢霉素A、 他克莫司、 依维莫司、 雷帕霉素等多种免疫抑制剂药物的释放， 便 于后续的LC ‑MS/MS的检测， 本试剂盒包括有A液和C液， 其中： [0007]A液中包括有用于破碎全血样本中的红细胞， 释放目标化合物， 同时重金属盐能使 蛋白质变性的硫酸锌； [0008]C液中包括有用于上清液复溶， 减少溶剂效应的 甲醇。 [0009]本发明还公开了一种检测人全血中多种免疫抑制剂药物的预处理试剂盒的使用 方法， 本方法包括以下步骤： S1、 一次振荡混匀； S2、 离心处理； S3、 加入C液； S4、 二次振 荡， 其 中： [0010]S1、 一次振荡混匀： 量取定量 的免疫抑制剂标线1～8、 质控和内标储备液， 精密吸 取全血样品或标线或质控40 ‑45 μL到1.5mL离心管中， 加入180 ‑220 μL A液和380 ‑420 μL内标 工作液， 室温振荡5分钟， 转速为10 00‑1100rpm； [0011]S2、 离心处理： 将步骤S1中振荡后的混合物放置到离心设备中进行离心， 其中： 离 心温度为 4℃‑7℃， 转速为10 00‑1400rpm； [0012]S3、 加入C液： 吸取步骤S2中离心后 混合液的上清液90 ‑120μL于96孔板， 加入100 ‑ 110 μL C液； [0013]S4、 二次振荡： 将步骤S3中加入C液的混合液振荡5分钟转速为10 00‑1100rpm。 [0014]作为本发明的进一步改进， 本方法步骤S1中量取的免疫抑制剂标线1～8、 质控和 内标储备 液需先进行恢复至室温， 振荡混匀处 理。 [0015]作为本发明的进一步改进， 本方法步骤S1中的内标工作液由内标储存液经用甲醇说　明　书 1/4 页 3 CN 115308328 A 3