(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221084024 4.5 (22)申请日 2022.07.18 (71)申请人 长春圣金诺生物制药有限公司 地址 130103 吉林省长 春市高新 开发区顺 达路1239 A号厂房 (72)发明人 张玉娜　白冰　张丽娜　鞠蒙蒙　 付中岳　李梦　刘恋　谢伟丽　 许乐　 (74)专利代理 机构 长春众邦菁华知识产权代理 有限公司 2 2214 专利代理师 周蕾 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) (54)发明名称 一种检测注射用重组尿酸氧化酶中聚山梨 酯80含量的方法 (57)摘要 本发明涉及一种检测注射用 重组尿酸氧化 酶中聚山梨酯80含量的方法， 涉及聚山梨酯 含量 检测技术领域。 本发明的检测注 射用重组尿酸氧 化酶中聚山梨酯80含量的方法， 将高效液相色谱 与蒸发光散射检测技术相结合， 通过优化检测条 件， 大大提高了聚山梨酯80含量检测的灵敏度、 准确性， 且能更快速的获得检测结果。 本发明的 检测注射用重组尿酸氧化酶中聚山梨酯80含量 的方法稳定专属性好， 特异性强， 准确度高， 操作 简便， 检测速度快， 能够满足聚山梨酯80的含量 测定。 权利要求书1页 说明书8页 附图1页 CN 115290772 A 2022.11.04 CN 115290772 A 1.一种检测注射用重组尿酸氧化酶中聚山梨酯80含量的方法， 其特征在于， 包括以下 步骤： 步骤1、 取聚山梨酯 80对照品， 加水稀释成系列浓度的对照品溶 液； 步骤2、 取系列浓度的对照品溶液分别注入高效液相色谱仪， 记录色谱图， 测量聚山梨 酯80峰面积， 以聚山梨酯80浓度的自然对数值X为横坐标， 色谱峰面积值的自然对数值Y为 纵坐标， 进行线性回归分析， 计算回归线的相关系数R2， 得到线性回归方程； 步骤3、 取注射用重组尿酸氧化酶， 加水 溶解并稀释后， 得到供 试品溶液； 步骤4、 取供试品溶液注入高效液相色谱仪， 记录色谱图， 测量供试品溶液峰面积， 将其 代入步骤2的线性回归方程， 计算得到注射用重组尿酸氧化酶中聚山梨酯 80的含量； 上述方法的测试 条件如下： 流动相： 流动相A： 2％甲酸水 溶液； 流动相B： 2％甲酸乙腈溶 液； 色谱条件： 流速： 0.9 ‑1.1mL/mi n； 漂移管温度： 69 ‑71℃； 雾化温度： 69 ‑71℃； 氮气压力： 1.5 ‑1.7SLM； 柱温： 室温； 上样量： 20 μL； 洗脱梯度如下： 洗脱时间： 0 ‑5min， 流动相A  80％、 流动相B  20％； 5.01‑7min， 流动相A  65％、 流动相B  35％； 7.01‑10min， 流动相A  20％、 流动相B  80％； 10.01‑12min， 流动相A  0％、 流动相B  100％； 12.01‑20min， 流动相A  80％、 流动相B  20％。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤1为取Sigma聚山梨酯80对照品， 加水 分别制成每1mL含0.0 6mg、 0.1mg、 0.2mg、 0.4mg、 0.6mg的聚山梨酯 80的对照品溶 液。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特 征在于， 所述方法的检测范围为0.0 6‑0.6mg/mL。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述方法所用色谱柱的型号为Waters Max 30um 3.0×20mm Column， 基质是混合型 阴离子交换反相吸附剂。 5.根据权利要求1所述的方法， 其特 征在于， 流速为1mL/mi n。 6.根据权利要求1所述的方法， 其特 征在于， 漂移管温度为70℃。 7.根据权利要求1所述的方法， 其特 征在于， 雾化温度为70℃。 8.根据权利要求1所述的方法， 其特 征在于， 氮气压力为1.6SLM 。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115290772 A 2一种检测注射用重组尿酸氧化酶中聚山梨酯80含量的方 法 技术领域 [0001]本发明涉及聚山梨酯含量检测技术领域， 具体涉及一种检测注射用重 组尿酸氧化 酶中聚山梨酯 80含量的方法。 背景技术 [0002]聚山梨酯80， 也称吐温80， 其主要成分是聚氧乙烯山梨醇酐油酸酯， 此外还含有聚 氧乙烯异山梨醇酐油酸酯及聚氧乙烯山梨醇酐、 聚氧乙烯异山梨醇酐等， 组分总数超过 1500种。 它作为一种非离子型表面活性剂， 能抑制蛋白的变性、 自动聚合与表面 吸附， 是生 物制药领域常用的乳化剂、 增溶剂、 润湿剂和稳定剂。 在水溶液状态， 聚山梨酯80易发生降 解， 酯类发生水解释放出游离脂肪酸、 聚氧乙烯(异)山梨醇酐； 酯类在光 或过渡金属的催 化 下发生自动氧化， 生成过氧化物等氧化产物。 降解引起的聚山梨酯80含量变化与水解或氧 化产物的生成， 将 影响蛋白制剂的稳定性、 药效与用药安全性， 所以确定聚山梨酯8 0在生物 制剂中的含量， 对于保证药品质量、 疗效及安全性是必不可少的。 [0003]现有对于聚山梨酯80含量检测的技术主要有： 直接测定聚山梨酯80含量的硫氰酸 铵钴显色检测法、 分子排阻 ‑蒸发光散射检测法(SEC ‑ELSD)、 液质联用法(LC ‑MS)， 水解后经 液相色谱 ‑紫外检测法(HPLC ‑UV)或气相色谱法(GC)间接测定聚山梨酯80含量的方法等等。 以上这些方法中硫氰酸铵钴显 色检测法对于蛋白制剂尤其是高浓度的单抗制剂， 需先使用 合适的有机溶剂沉淀去除蛋白， 准确度、 重复性差和 灵敏度也较低， 并对环境有害。 TANI等 发表了利用高效液相一步定量聚山梨酯8 0的方法， 通过在流动相中加入聚山梨酯8 0来缩短 洗脱时间， 但洗脱峰仍较宽， 对称性较差， 而且未考查该方法的准确度是否会受蛋白浓度的 影响。 U等利用水解聚山梨酯80产生油酸， 经RP ‑HPLC分离和紫外检测器检测的方法， 来定量 药物悬液中聚山梨酯80的含量， 该方法具有较高的准确度和精密度， 但因油酸稳定性较差 而受到限制， 而且对于蛋白制剂， 该水解过程也会使蛋白水解， 产物在紫外有响应， 可能会 影响检测。 以上方法不是方法费时又费力、 不适合大样本定量测定， 就是不具有理想的分离 度和分辨率， 或是受质量光谱差和 缺乏确定所有 峰的影响， 且大多数用于中药制剂 中而在 生物制剂相关研究较少。 发明内容 [0004]本发明要解决现有技术中的技术问题， 提供一种检测注射用重 组尿酸氧化酶中聚 山梨酯80含量的方法。 本发明的方法将 高效液相色谱与蒸发光散射检测技术相结合， 通过 优化检测条件， 大大提高了聚山梨酯8 0含量检测的灵敏度、 准确性， 且能更快速的获得检测 结果。 [0005]为了解决上述 技术问题， 本发明的技 术方案具体如下： [0006]本发明提供一种检测注射用重组尿酸氧化酶中聚山梨酯80含量的方法， 包括以下 步骤： [0007]步骤1、 取聚山梨酯 80对照品， 加水稀释成系列浓度的对照品溶 液；说　明　书 1/8 页 3 CN 115290772 A 3