(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210986777.4 (22)申请日 2022.08.17 (71)申请人 北京豪思生物科技股份有限公司 地址 102200 北京市昌平区回龙观镇科 学 园路7号院1号楼1层102-2 申请人 江苏豪思睦可生物科技有限公司 　 湖南豪思生物科技有限公司 (72)发明人 肖冰心　王春静　栗琳　张红　 雒琴　贾子强　周立　丁亮　 (74)专利代理 机构 北京超凡宏宇专利代理事务 所(特殊普通 合伙) 11463 专利代理师 颜欢 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/34(2006.01)G01N 30/72(2006.01) (54)发明名称 一种测定样本中神经酰胺的方法及其产品 和应用 (57)摘要 本发明公开了一种测定样本中神经酰胺的 方法及其产品和应用， 涉及生物检测技术领域， 本发明提供了一种适用于同时检测多种神经酰 胺的方法， 该方法优化了色谱洗脱采用的流动相 以及梯度洗脱程序， 使得多种神经酰胺能够在 4.5min内完成分离和检测， 分析时间短、 通量高， 且避免或减少了干扰峰 的影响， 使得待测神经酰 胺的检测信号能够与干扰峰有效分离， 从而获得 稳定性高、 精准度好的检测结果。 权利要求书2页 说明书28页 附图17页 CN 115508466 A 2022.12.23 CN 115508466 A 1.一种测定样本 中神经酰胺的方法， 其特征在于， 其包括： 采用液相色谱串联质谱的方 法检测样本中的神经酰胺； 所述色谱包括采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱， 所述流动 相A包括含甲酸的乙酸铵 水溶液， 所述流动相B 包括含甲酸的乙腈和甲基叔丁基醚的混合溶 液； 色谱的洗脱条件如下： 0～1min， 流动相A的体积百分比维持在30～40％， 流动相 B的体积百分比维持在60 ％～ 70％； 1～1.5min， 流动相A体积百分比由30％～40％降至20％～30％， 流动相B体积百分比由 60～70％增至70％～80％； 1.5～3.5min， 流动相A体积百分比由20％～30％降至1％～10％， 流动相B体积百分比 由70％～80％增至90％～ 99％； 3.5～3.6min， 流动相A体积百分比由1％～10％增至30％～40％， 流动相B体积百分比 由90％～ 99％降至60％～70％； 3.6～4.5min， 流动相A体积百分比维持在30％～40％， 流动相 B体积百分比维持在60％ ～70％； 所述神经酰胺包括： Cer(d18:1/ 14:0)、 Cer(d18:1/ 16:0)、 Cer(d18:1/ 18:0)、 Cer(d18: 1/20:0)、 Cer(d18:1/22:0)、 C er(d18:1/24:0)和C er(d18:1/24:1)中的至少一种； 所述方法 不以疾病的诊断或治疗为 直接目的。 2.根据权利要求1所述的测定样本 中神经酰胺的方法， 其特征在于， 所述色谱的洗脱条 件如下： 0～1min， 流动相A的体积百分比维持在3 5％， 流动相B的体积百分比维持在6 5％； 1～1.5min， 流动相A体积百分比由35％降至25％， 流动相B体积百分比由65％增至 75％； 1.5～3.5min， 流动相A体积百分比由25％降至5％， 流动相B体积百分比由75％增至 95％； 3.5～3.6min， 流动相A体积百分比由5％增至35％， 流动相B体积百分比由95％降至 65％； 3.6～4.5mi n， 流动相A体积百分比维持在3 5％， 流动相B体积百分比维持在6 5％。 3.根据权利要求2所述的测定样本 中神经酰胺的方法， 其特征在于， 所述梯度洗脱的流 速为0.1～1mL/mi n。 4.根据权利要求1所述的测定样本 中神经酰胺的方法， 其特征在于， 所述色谱采用的色 谱柱包括C8色谱柱和苯基色谱柱中的任意 一种； 优选地， 所述C8色谱柱选自飞诺美Kinetex  C8， 岛津shim ‑pack‑GIST‑HP C8以及与飞 诺美Kinetex  C8或岛津shim ‑pack‑GIST‑HP C8具有相似类型固定相键合相或型号的色谱 柱中的任意 一种； 优选地， 所述飞诺美Ki netex C8的型号 为50×3mm,2.6 μm； 优选地， 所述岛津shim ‑pack‑GIST‑HP C8的型号 为50×2.1,3 μm； 优选地， 所述苯基色谱柱包含飞诺美Kinetex  Phenyl‑Hexyl或具有相似类型固定相键 合相或型号的色谱柱；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115508466 A 2优选地， 所述飞诺美Ki netex Phenyl‑Hexyl的型号 为50×4.6,2.6 μm； 优选地， 所述色谱柱为岛津shim ‑pack‑GIST‑HP C8； 优选地， 所述色谱的条件包括： 色谱柱的柱温为35～45℃， 进样器温度为5～15℃， 进样 量为2～5 μL。 5.根据权利要求1所述的测定样本 中神经酰胺的方法， 其特征在于， 所述流动相B中， 乙 腈和甲基叔 丁基醚的体积比为(70～80)： (20:3 0)； 优选地， 所述 流动相B中， 乙腈和甲基叔 丁基醚的体积比为75： 25； 优选地， 所述 流动相B中， 甲酸的体积浓度分数为0.01％～0.5％； 优选地， 所述 流动相A中甲酸的体积浓度分数为0.01％～0.5％。 6.根据权利要求1所述的测定样本 中神经酰胺的方法， 其特征在于， 质谱采用电喷雾离 子源， 检测方式为正离子模式， 扫描方式为多重反应监测， 去 溶剂温度为550℃， 雾化气流速 (GAS1)为5 5， 去溶剂流速(GAS2)为5 5,离子源电压(IS)为5 500V。 7.根据权利要求1～6任一项所述的测定样本中神经酰胺的方法， 其特征在于， 所述样 本包括血 液样本。 8.根据权利要求7所述的测定样本 中神经酰胺的方法， 其特征在于， 所述液相色谱串联 质谱检测包括样 本前处理步骤， 所述样本前 处理包括： 将待测样本、 内标和沉淀剂混合以进 行蛋白沉淀， 去除沉淀后用于液相色谱串联质谱检测； 优选地， 所述 沉淀剂包括甲醇； 优选地， 所述内标溶液包括： Cer(d18:1/16:0)的内标物、 Cer(d18:1/18:0)的内标物、 Cer(d18:1/24:0)的内标物和Cer(d18 :1/24:1)的内标物中的至少一种； 优选地， 所述内标溶液包括： Cer(d18:1/16:0)氘代物、 Cer(d18:1/18:0)氘代物、 Cer (d18:1/24:0)氘代 物和Cer(d18 :1/24:1)氘代 物中的至少一种。 9.试剂组合在制备测定样本中神经酰胺的产品中的应用， 其特征在于， 所述试剂组合 包括用于实现如权利要求1～8任一项所述方法的试剂， 所述神经酰胺包括： Cer(d18:1/14: 0)、 Cer(d18:1/16:0)、 Cer(d18:1/18:0)、 Cer(d18:1/20:0)、 Cer(d18:1/22:0)、 Cer(d18:1/ 24:0)和Cer(d18 :1/24:1)中的至少一种； 优选地， 所述样本包括血 液样本。 10.一种测定样本 中神经酰胺的产品， 其特征在于， 其包括用于实施如权利要求1～8任 一项所述的测定样本中神经酰胺的方法的试剂。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115508466 A 3