(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211033316.1 (22)申请日 2022.08.26 (71)申请人 益诺思生物技 术南通有限公司 地址 226133 江苏省南 通市海门区临江镇 洞庭湖路10 0号A18楼 (72)发明人 缪峰　季金风　王勇　孙璐瑶　 (74)专利代理 机构 上海弼兴律师事务所 31283 专利代理师 张云燕　余化鹏 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/30(2006.01) G01N 30/32(2006.01) G01N 30/34(2006.01) G01N 30/72(2006.01) (54)发明名称 一种测定眼球壁中那他霉素的方法 (57)摘要 本发明公开了一种测定眼球壁中那他霉素 的方法。 其采用液相色谱 ‑质谱联用法测定眼球 壁待测液中那他霉素的含量； 液相色谱的流动相 包括流动相A和流动相B； 流动相A为有机酸水溶 液， 流动相A中的有机酸占流动相A体积的 0.002％～0.1％； 流动相B为有机酸与乙腈的混 合液， 流动相B中的有机酸占流动相B体积的 0.002％～ 0.1％； 流动相A和流动相B的体积比为 x:(100‑x)， 其中， 10≤x≤80； 有机酸为甲酸或乙 酸； 眼球壁待测液包括那他霉素和内标物。 该方 法的检测限低、 准确度高且操作简便 。 权利要求书3页 说明书18页 附图15页 CN 115452976 A 2022.12.09 CN 115452976 A 1.一种测定眼球壁中那他霉素的方法， 其特征在于， 其采用液相色谱 ‑质谱联用法测定 眼球壁待测液中那他霉素的含量； 所述液相色谱 ‑质谱联用法中的液相色谱的流动相包括流动相A和流动相B； 所述流动 相A为有机酸水溶液， 所述流动相A中的有机酸占所述流动相A体积的0.002％～0.1％； 所述 流动相B为有机酸与乙腈的混合液， 所述流动相B中的有机酸占所述流动相B体积的0.002％ ～0.1％； 所述流动相A和所述流动相B的体积比为x:(100 ‑x)， 其中， 10≤x≤80； 所述有机酸 为甲酸或乙酸； 所述眼球壁待测液包括那他霉素和内标物。 2.如权利要求1所述的测定 眼球壁中那他霉素的方法， 其特征在于， 所述液相色谱 ‑质 谱联用法采用液质联用仪； 较佳地， 所述液质联用仪的型号 为SCIEX/Triple  Quad 4500； 和/或， 所述液相色谱 ‑质谱联用法中， 所述液相色谱的色谱柱固定相为十八烷基键合 硅胶， 例如Y MC‑Triart C18； 和/或， 所述液相色谱 ‑质谱联用法中， 所述液相色谱的色谱柱的规格为50mm ×2.1mm, 1.9 μm； 和/或， 所述液相色谱 ‑质谱联用法中， 所述液相色谱的柱温为3 0～50℃， 例如40℃； 和/或， 所述液相色谱 ‑质谱联用法中， 所述液相色谱的进样量 为1～20 μL， 例如5 μL； 和/或， 所述液相色谱 ‑质谱联用法中， 所述质谱的离 子源为电喷雾电离 ESI； 和/或， 所述液相色谱 ‑质谱联用法中， 所述质谱的离 子化模式为 正离子化模式； 和/或， 所述液相色谱 ‑质谱联用法中， 所述质谱采用多反应检测模式； 较佳地， 所述多 反应监测模式中， 所述那他霉素的母离子的质荷比为666.3， 子离子的质荷比为503.3； 更佳 地， 当内标物为甲苯磺丁脲， 所述甲苯磺丁脲中的母离子的质荷比为271.1， 子离子的质荷 比为154.8； 和/或， 所述液相色谱 ‑质谱联用法中， 所述质谱的扫描间隔时间为70～90ms， 例如 80ms。 3.如权利要求1所述的测定眼球壁中那他霉素的方法， 其特征在于， 所述液相色谱的洗 脱方式采用梯度洗脱； 较佳地， 不同时间段， 所述 流动相A和所述 流动相B的体积比如下表： 和/或， 所述液相色谱的流动相的流速为0.4～0.6mL/mi n， 例如0.5mL/mi n； 和/或， 所述 流动相A中的有机酸占所述 流动相A体积的0.0 5％～0.1％， 例如0.1％；权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115452976 A 2和/或， 所述 流动相B中的有机酸占所述 流动相B体积的0.0 5％～0.1％， 例如0.1％。 4.如权利要求1所述的测定眼球壁中那他霉素的方法， 其特征在于， 所述眼球壁包括角 膜、 巩膜、 虹膜、 脉络膜和视网膜中的一种或多种； 和/或， 所述眼球壁 为新西兰大白兔的眼球壁； 和/或， 所述内标物为甲苯磺丁脲 。 5.如权利要求1所述的测定眼球壁中那他霉素的方法， 其特征在于， 所述眼球壁待测液 的制备方法包括如下步骤： S1、 将含有那他霉素的眼球壁剪碎后， 得到眼球壁样品， 加入匀 浆液进行研磨匀浆， 得到眼球壁匀浆液； S2、 将S1 中所述眼球壁匀浆液与内标物进 行第一次 涡旋混匀； S3、 将S2中所述涡旋混合的溶液进行离心， 取上清液进行第二次涡旋混匀， 即得 所述眼球壁待测液。 6.如权利要求5所述的测定眼球壁中那他霉素的方法， 其特征在于， 所述眼球壁样品与 所述匀浆液的体积比为1:(8～ 20)， 例如1:10； 和/或， 所述匀浆液为甲醇和水的混合液； 较佳地， 所述甲醇占所述匀浆液的体积的 10％～50％， 例如5 0％； 和/或， 所述第一次涡旋混匀 和第二次涡旋混匀的速度均为3～8m/sec， 例如8m/sec； 和/或， 所述第一次涡旋混匀 和第二次涡旋混匀的转动时间均为5 0～70s， 例如6 0s； 和/或， 所述第一次涡旋混匀 和第二次涡旋混匀的次数均为至少3次， 例如3次； 和/或， 所述离心的温度为 4℃； 和/或， 所述离心的离心力为 4700×g； 和/或， 所述离心的时间为10mi n。 7.如权利要求1所述的测定眼球壁中那他霉素的方法， 其特征在于， 在检测所述眼球壁 待测液之前， 建立标准曲线； 较佳地， 所述标准曲线的建立包括如下步骤： ①配制那他霉素 标准品工作液和内标工作液； ②将步骤①中所述的标准品工作液与空白眼球壁基质混合， 得到标准样品溶 液； ③将步骤①中所述的内标工作液加入步骤 ②中所述的标准样品溶液， 进行涡旋混合、 离心， 取上清液， 涡旋混合， 得到标准品待测液； ④采用所述液相色谱 ‑质谱联用法分析步骤 ③中所述标准品待测液， 测得那他霉素与 所述内标物的峰面积比； ⑤根据所述那他霉素与所述内标物的峰面积比和所述标准品工作液的浓度拟合， 得到 回归方程， 并绘制所述标准曲线， 即可。 8.如权利要求7所述的测定 眼球壁中那他霉素的方法， 其特征在于， 步骤 ①中， 所述标 准品工作液包括那他霉素和稀释液； 所述稀释液为5 0％甲醇水 溶液； 和/或， 步骤 ①中， 所述标准品工作液的配制方法包括以下步骤： 将所述那他霉素与稀 释液混合， 得到标准品储备 液； 再将所述标准品储备 液与所述稀释液混合， 即可； 和/或， 步骤 ①中， 所述标准品工作液中的那他霉素的浓度为4ng/mL、 10ng/mL、 50ng/ mL、 100ng/mL、 20 0ng/mL、 5 00ng/mL、 10 00ng/mL或20 00ng/mL； 和/或， 步骤 ①中， 所述内标工作液包括甲苯磺丁脲与内标稀释液； 较佳地， 所述内标稀 释液为乙腈； 和/或， 步骤 ①中， 所述内标工作液的配制方法包括以下步骤： 将所述内标物与所述内权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 115452976 A 3