(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210921653.8 (22)申请日 2022.08.02 (71)申请人 兆科 （广州） 眼科 药物有限公司 地址 511462 广东省广州市南沙区珠 江工 业园美德三路1号自编A区5层5 01房 (72)发明人 谢志军　谭平　 (74)专利代理 机构 北京东正专利代理事务所 (普通合伙) 11312 专利代理师 李梦福 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/34(2006.01) G01N 30/32(2006.01) G01N 30/54(2006.01) G01N 30/74(2006.01) (54)发明名称 一种生发肽制剂中有关物质的分析方法 (57)摘要 本发明公开了一种生发肽制剂中有关物质 的分析方法， 采用高效液相色谱进行测定， 其中 色谱柱采用YMC ‑Triart C18， 4.6×150mm， 3um色 谱柱， 柱温为35℃， 进样量为100微升， 检测波长 为210nm， 流动相A为0.1 ％三氟乙酸水溶液、 流动 相B为0.1％三氟乙酸乙腈， 采用梯度洗脱， 洗脱 程序为： 0min： 流动相A与流动相B的体积比为 100:0； 8min～13min： 流动相A与流动相B的体积 比为85:15； 13min之后至20min： 流动相A与流动 相B的体积比为100:0。 本发明的分析检测方法， 其主峰与杂质峰的分离度佳(2.5)， 峰型、 拖尾 (1.1)及理论塔板数(13000)均较好， 而且检测时 间短(20min)， 为本类产品的质量标准制定提供 了一种有效的方法。 权利要求书1页 说明书6页 附图7页 CN 115266995 A 2022.11.01 CN 115266995 A 1.一种生发肽制剂中有关物质的分析 方法， 其特 征在于， 该分析 方法包含以下步骤： (1)准备样品； (2)采用高效液相色谱法进行检测； 其中， 所述高压液相色谱柱法采用以十八烷基硅烷 键合硅胶为填充剂的色谱柱； 所述高压液相色谱柱法的流动相包括流动相A和流动相B， 其 中流动相A为三氟乙酸水溶液， 其中三氟乙酸和水的体积比为0.05:100至0.15:100， 流动相 B为三氟乙酸 ‑乙腈。 2.根据权利要求1所述生发肽制剂中有关物质的分析方法， 其特征在于， 所述流动相B 中三氟乙酸与乙腈的体积比为0.0 5:100至0.15:100。 3.根据权利要求1所述生发肽制 剂中有关物质的分析方法， 其特征在于， 所述色谱柱的 柱温为30～40℃。 4.根据权利要求1所述生发肽制 剂中有关物质的分析方法， 其特征在于， 高效液相色谱 法的进样量 为90～110 μl。 5.根据权利要求1所述生发肽制 剂中有关物质的分析方法， 其特征在于， 所述高压液相 色谱法中的检测波长为210nm。 6.根据权利要求1所述生发肽制 剂中有关物质的分析方法， 其特征在于， 所述色谱柱选 自Waters色谱柱、 Agilent色谱柱、 Thermos色谱柱、 Phenomenex色谱柱、 Shimatsu色谱柱或 YMC色谱柱中的一种。 7.根据权利要求1所述生发肽制 剂中有关物质的分析方法， 其特征在于， 所述色谱柱的 规格为4.6×150mm， 3 μm。 8.根据权利要求1所述生发肽制 剂中有关物质的分析方法， 其特征在于， 所述高压液相 色谱法采用梯度洗脱， 所述梯度洗脱的程序为： 0min： 流动相A与流动相B的体积比为10 0:0； 8min： 流动相A与流动相B的体积比为83:17至87:13； 8min～13min： 流动相A与流动相B的体积比为83:17至87:13； 13min之后直到20mi n： 流动相A与流动相B的体积比为10 0:0。 9.根据权利要求1所述生发肽制 剂中有关物质的分析方法， 其特征在于， 所述高压液相 色谱法采用梯度洗脱， 所述梯度洗脱的程序为： 0min： 流动相A与流动相B的体积比为10 0:0； 8min： 流动相A与流动相B的体积比为85:15； 8min～13min： 流动相A与流动相B的体积比为85:15； 13min之后直到20mi n： 流动相A与流动相B的体积比为10 0:0。 10.权利要求1 ‑9任一项所述生发肽制剂中有关物质的分析方法在生发肽制剂质量控 制中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115266995 A 2一种生发肽制剂中有关物质的分析方 法 技术领域 [0001]本发明涉及分析化学 领域， 特别涉及一种生发肽制剂中有关物质的分析 方法。 背景技术 [0002]生发肽为胸腺肽Tβ4中与肌动蛋白结合的核心功能区， 由美国国立卫生研究院 (NIH)科学家研究发现， 共七个氨基酸组成， 序列为亮氨酸 ‑赖氨酸‑赖氨酸‑苏氨酸‑谷氨 酸‑苏氨酸‑谷氨酰胺(L ‑K‑K‑T‑E‑T‑Q)。 研究表明， 生发肽具有键合肌动蛋 白、 促进毛发生 长、 刺激血 管再生、 加速表皮伤口愈合及促进细胞迁移等多种功能。 [0003]药效学试验和安全性评价试验结果表明， 生发肽安全无毒， 具有促进大鼠角膜上 皮修复， 减轻炎症反应的作用。 生发肽滴眼液 的适应症为干眼症引起的角膜上皮点状缺损 和各种原因(包括 Ⅰ、Ⅱ度烧伤、 机 械伤、 医源性)引起的角膜上皮片状缺损。 [0004]生发肽在合成过程中可能生成差向异构体、 缺失肽、 插入肽等， 得到了所有的单个 位点的差向异构体7个(其中Thr的非对映异构体为D ‑allo结构)， 以及容易产生的缺失肽杂 质6个、 插入肽杂质13个、 错接肽杂质7个、 断裂肽杂质10个， 同时根据其序列结构和工艺， 合 成了容易降解产生的IM 020/Glu7杂质， 研究了共计4 4个杂质。 [0005]目前在中国药典并没有原料药的检测方法， 生发肽生产商浙江湃肽生物股份有限 公司提供的检测方法为： [0006]色谱柱： Y MC‑PackODS‑AQ 4.6×250mm， 3 μm(日本 YMC公司生产的C18高效色谱柱) [0007]柱温： 45℃ [0008]流动相A： 5 0mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)流动相B： 5 0％甲醇 [0009]流速： 0.8ml/mi n [0010]进样量： 20ul(2mg/ml) [0011]检测波长： UV 210nm [0012]洗脱梯度： [0013]时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 98 2 30 92 8 40 40 60 50 40 60 51 98 2 60 98 2 [0014]如图1‑3所示， 图1为现有技术中生发肽检测的谱图、 图2为现有技术中生发肽中 API与杂质A(Glu7‑生发肽)的谱图、 图3为现有技术中生发肽中API与杂质B(D ‑Leu1‑生发肽) 和杂质C(Di ‑Glu5‑生发肽)的谱图。 上述检测方法的问题是， 检测的时间长达50min以上， 影 响检测效率， 同时检测多个杂质的专属性不好， 杂质于主峰的分离度欠佳， 且混标检测后， 前面的两个杂质分离度很差(远小于1.5)， 而且主峰后的杂质根本无法实现基线分离， 无法说　明　书 1/6 页 3 CN 115266995 A 3